高通量测序

一、read、count数

1. reads：高通量测序产生的序列片段，将这些reads拼接起来就能获得基因组全序列，不同片段reads的量代表基因表达水平
2. Count：比对定量，将测得的短reads比对到参考基因组外显子上，通过算法计算能真正比对到基因组上的reads数量，得到粗略基因表达水平，因此count一定是个非负整数；包含三种算法：union  ，intersection-strict ，intersection-nonempty

 

    3、read、count数是基因差异分析软件(只能使用DESeq、edgeR包，可自动归一化)的输入值，也用于换算CPM、RPKM、FPRM等其他指标，差异分析、降维结果主要来自read、count 

 二、可变剪切：基因转录后先形成前体mRNA，通过剪切内含子连接外显子，5’加帽、3’加尾后形成成熟mRNA，剪切过程中可能会剪掉外显子，也可能保留部分内含子，因此同一个基因会产生不同的转录本。

三、测序深度（Sequencing Depth）：测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小（Genome）的比值。假设一个基因组大小2M（2Mb=2000kb=2,000,000bp，200万个碱基对），测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M，即被测基因组上单个碱基对被测序的平均次数。

      测序的覆盖度（coverage）：测序获得的序列占整个基因组的比例，即对目的基因的覆盖程度。测序无法覆盖的区域称为Gap。

 

四、GC偏好：基因组上GC含量50%左右的区域更易被测到、覆盖度更高、产生的reads更多，高及低GC区不易被测到，产生的reads较少，这些区域的覆盖度更少。

 五、Normalization归一化原因：测序偏差 bias

1. 测序深度：某些低表达量的基因只有在较高的测序深度时才能检测到。一般而言，随着测序深度的增加，基因种类以及可变剪接体的数目也会增加。同时，测序深度高的样本read counts也会较高。
2. 转录本长度：高通量测序是将cDNA碎片化产生fragments后再进行测序，越长的转录本，在测序中也会更加容易被检测到。

 六、主要归一化方法及比较

1. RPKM→FPKM→TPM都用来表示基因的表达量。
2.  

     3、DEseq2

     4、EdgeR

 七、丰度

     1、基因丰度：基因组中该基因的拷贝数；基因丰度高即基数多，则此基因的表达量可能也会多，主要看该基因启动子的强弱，所以基因丰度高不代表表达丰度也高。

     2、基因表达丰度：基因转录成mRNA的数量。表达丰度高则转录成的mRNA多，表达的蛋白也多，对表型的影响大。

    3、丰度一般用来形容体细胞基因突变，比如癌症细胞突变基因丰度=突变基因/(突变基因+正常基因)，可用于指导临床诊疗