【Qiime2】新手入门（含官方示例数据）

---

前言

提示：以下内容只作参考，具体使用方法以Qiime2官网为准：

Qiime2官方使用教程：https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/

---

一、Qiime2数据导入、导出和过滤

1.导入数据

1）下载示例数据：

#先创建一个文件夹用来保存示例数据
mkdir example-sequences
cd example-sequences
#下载示例数据
wget -O "casava-18-paired-end-demultiplexed.zip" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/importing/casava-18-paired-end-demultiplexed.zip"
#解压数据
unzip -q casava-18-paired-end-demultiplexed.zip

2）导入示例数据：

qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path casava-18-paired-end-demultiplexed \
  --input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt \
  --output-path demux-paired-end.qza

2.导出数据

有时需要从 QIIME 2 导出数据，例如使用不同的微生物组分析程序分析数据，或者在 R 中进行统计分析。

1）下载示例数据：

代码如下：

#创建示例数据文件夹
mkdir export-data
cd export-data
#下载特征表示例数据
wget -O "feature-table.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/exporting/feature-table.qza"
#下载进化树示例数据
wget \
  -O "unrooted-tree.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/exporting/unrooted-tree.qza"

2）导出

代码如下：

#导出特征表示例数据为BIOM v2.1.0 格式的文件
qiime tools export \
  --input-path feature-table.qza \
  --output-path exported-feature-table
#导出进化树示例数据为newick格式的文件
qiime tools export \
  --input-path unrooted-tree.qza \
  --output-path exported-tree

3.过滤数据

如何在 QIIME 2 中过滤特征表、序列和距离矩阵

1）下载示例数据：

代码如下：

#创建示例数据文件夹
mkdir qiime2-filtering-tutorial
cd qiime2-filtering-tutorial
#下载示例数据
wget -O "sample-metadata.tsv" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/sample_metadata.tsv"

wget -O "table.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/filtering/table.qza"

wget -O "distance-matrix.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/filtering/distance-matrix.qza"

wget \
  -O "taxonomy.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/filtering/taxonomy.qza"

wget \
  -O "sequences.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/filtering/sequences.qza"
  

2）Filtering feature tables

• Total-frequency-based filtering

1、当过滤样本时，可以使用它来过滤总频率是样本频率分布中的异常值的样本。
在本例中，总频率小于1500的样本将被过滤。代码如下：

qiime feature-table filter-samples \
  --i-table table.qza \
  --p-min-frequency 1500 \
  --o-filtered-table sample-frequency-filtered-table.qza

2、应用于特征轴以从表中删除低丰度特征。例如，删除总丰度（所有样本的总和）小于 10 的所有特征，代码如下

qiime feature-table filter-features \
  --i-table table.qza \
  --p-min-frequency 10 \
  --o-filtered-table feature-frequency-filtered-table.qza

• Total-frequency-based filtering

基于偶然性的过滤用于根据样本包含的特征数量从表中过滤样本，或者根据观察到的样本数量从表中过滤特征。这种过滤通常用于过滤仅在一个或几个样本中出现的特征，因为怀疑这些特征可能并不代表真正的生物多样性，而是代表 PCR 或测序错误（例如 PCR 嵌合体）。

1、从特征表中过滤掉仅存在于单个样本中的特征，代码如下：

qiime feature-table filter-features \
  --i-table table.qza \
  --p-min-samples 2 \
  --o-filtered-table sample-contingency-filtered-table.qza

2、从特征表中过滤仅包含少量特征的样本，代码如下：

qiime feature-table filter-samples \
  --i-table table.qza \
  --p-min-features 10 \
  --o-filtered-table feature-contingency-filtered-table.qza

• Identifier-based filtering
• Metadata-based filtering
• Taxonomy-based filtering of tables and sequences

---

二、常用功能

1. 使用 q2-vsearch 将序列聚类成 OTU

1）下载示例数据：

代码如下：

#创建示例数据文件夹
mkdir qiime2-otu-clustering-tutorial
cd qiime2-otu-clustering-tutorial

#下载示例数据
wget -O "seqs.fna" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/otu-clustering/seqs.fna"

wget -O "85_otus.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/otu-clustering/85_otus.qza"

2）将数据导入 QIIME 2

qiime tools import \
  --input-path seqs.fna \
  --output-path seqs.qza \
  --type 'SampleData[Sequences]'

#After importing data, you can dereplicate it with the dereplicate-sequences command.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
  --i-sequences seqs.qza \
  --o-dereplicated-table table.qza \
  --o-dereplicated-sequences rep-seqs.qza

3）De novo clustering

In this example, clustering is performed at 99% identity to create 99% OTUs

qiime vsearch cluster-features-de-novo \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --p-perc-identity 0.99 \
  --o-clustered-table table-dn-99.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-dn-99.qza

4）Closed-reference clustering

In this example, clustering is performed at 85% identity against the Greengenes 13_8 85% OTUs reference database (85_otus.qza).

qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --i-reference-sequences 85_otus.qza \
  --p-perc-identity 0.85 \
  --o-clustered-table table-cr-85.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-85.qza \
  --o-unmatched-sequences unmatched-cr-85.qza

5）Open-reference clustering

Like the closed-reference clustering example above, open-reference clustering can be performed using the qiime vsearch cluster-features-open-reference command.

qiime vsearch cluster-features-open-reference \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --i-reference-sequences 85_otus.qza \
  --p-perc-identity 0.85 \
  --o-clustered-table table-or-85.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-or-85.qza \
  --o-new-reference-sequences new-ref-seqs-or-85.qza

2. 使用 q2-phylogeny进行系统发育推断

1）下载示例数据：

代码如下：

#创建示例数据文件夹
mkdir qiime2-phylogeny-tutorial
cd qiime2-phylogeny-tutorial

#下载示例数据
wget -O "rep-seqs.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2024.2/tutorials/phylogeny/rep-seqs.qza"

2）多重序列比对

构建多重序列比对的算法有很多。例如，利用q2-alignment中的MAFFT（Multiple Alignment using Fast Fourier Transform）进行比对

qiime alignment mafft \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs.qza

#Reducing alignment ambiguity
qiime alignment mask \
  --i-alignment aligned-rep-seqs.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza

3）构建系统发育树

Fasttree，能够从大型序列比对中相当快速地构建系统发育树

qiime phylogeny fasttree \
  --i-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree fasttree-tree.qza

Raxml，与fasttree一样，raxml将执行单次系统发育推断并返回一棵发育进化树。

qiime phylogeny raxml \
  --i-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --p-substitution-model GTRCAT \
  --o-tree raxml-cat-tree.qza \
  --verbose

IQ-TREE，我们为IQ-TREE提供了类似的功能：iqtree和iqtree-ultrafast-bootstrap。

qiime phylogeny iqtree \
  --i-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree iqt-tree.qza \
  --verbose

---