单细胞+Bulk+流式｜思路清晰，衰老特征怎么验证单基因？

今天给大家分享一篇JCR一区，单细胞的文章：PPARγ attenuates cellular senescence of alveolar macrophages in asthma-COPD overlap

• 标题：PPARγ在哮喘-COPD重叠中衰减肺泡巨噬细胞的细胞衰老
• 发表日期：2024年4月
• 期刊：Respiratory Research
• 影响因子：5.8
• 中科院分区：医学2区
• 小类：免呼吸系统2区

摘要

背景：
哮喘-慢性阻塞性肺病（COPD）重叠（ACO）代表了一种复杂的情况，老年人中具有哮喘和COPD的共享临床和病理生理特征。然而，ACO的病理生理学尚未被探索。我们旨在确定ACO中的主要炎症细胞，检查这些细胞内的衰老，并阐明调节衰老的基因。

方法：
进行生物信息学分析，以调查从ACO患者肺组织中获得的公共单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据集中的主要细胞类型和细胞衰老特征。在独立的队列研究“免疫机制严重哮喘”（IMSA）中进行了类似的分析，该研究包括来自支气管肺泡灌洗液（BALF）样本的大量RNA-Seq和CyTOF数据。

结果：
对scRNA-Seq数据的分析显示，在ACO患者的肺组织中，单核细胞/巨噬细胞是主要的细胞类型，占分析的细胞的50％以上。ACO患者的肺单核细胞/巨噬细胞表现出较低的衰老普遍性，其定义为SenMayo的低富集分数和细胞衰老标志物的表达水平。有趣的是，对IMSA数据集的分析显示，在严重哮喘患者中也有类似的结果。他们也表现出较低的衰老普遍性，特别是在气道CD206+巨噬细胞中，同时伴有细胞因子表达的增加（例如，IL-4，IL-13和IL-22）。进一步的探索确定了肺泡巨噬细胞作为ACO中驱动细胞衰老的主要单核细胞/巨噬细胞亚型。与氧化还原、细胞因子和生长因子相关的差异表达基因被认为在调节ACO中肺泡巨噬细胞衰老中起作用。PPARγ（过氧化物酶体增殖物活化受体γ） emerge作为调节ACO中肺泡巨噬细胞衰老特征的主要调节因子之一。

结论：
研究结果表明，巨噬细胞，特别是肺泡巨噬细胞中的衰老在ACO的病理生理中起着关键作用。此外，PPARγ可能代表一个潜在的治疗靶点，用于调节ACO中与衰老相关的过程。

关键词：ACO，哮喘，COPD，巨噬细胞，衰老，PPARγ。

结果

在ACO患者中，肺泡巨噬细胞是主要的细胞类型。

• A，从ACO患者（n = 1）和非ACO患者（n = 2）的人类肺组织中生成的scRNA-Seq数据集中鉴定了总共12个细胞簇。
• B，通过使用SingleR算法将（A）中的细胞簇进一步注释为不同的细胞类型。
• C，热图表示（B）中每种细胞类型的顶级差异表达基因。
• D，ACO和对照组中每种细胞类型的相对百分比。
• E，通过使用Leiden算法在单核细胞/巨噬细胞中鉴定了总共7个簇。
• F，通过使用Leiden算法在单核细胞/巨噬细胞中鉴定了总共7个簇。
• G，热图表示（F）中每种细胞类型的顶级差异表达基因。
  对类别变量进行了卡方检验以进行比较。

ACO患者单核细胞/巨噬细胞中的细胞衰老减少。

• A，肺单核细胞/巨噬细胞中AUCell富集的SenMayo衰老评分密度。
• B，单核细胞/巨噬细胞中ACO组和对照组的分布。
• C，ACO组和对照组中SenMayo衰老的富集评分。
• D，ACO组和对照组中每种单核细胞/巨噬细胞亚型的相对百分比。
• E，ACO组和对照组中每个细胞周期阶段的相对百分比。
• F-G，ACO组和对照组中细胞衰老标志物CDKN1A（p21，F）和CDKN2A（p16，G）的表达。对类别变量进行了卡方检验以进行比较。对数值变量进行了Wilcox秩和检验以进行比较。 p <0.05被视为统计学显著性。

IMSA数据集中严重哮喘患者衰老普遍性较低。

• A，通过重复的共识聚类分析，使用不同的k值（从2到5）在IMSA数据集中鉴定稳定和有意义的簇。
• B，通过累积分布函数（CDF）鉴定一致且稳定的细胞衰老簇。
• C，根据ssGSEA SenMayo衰老评分将两个簇分为衰老低和高组。
• D-F，衰老聚类低组和高组中细胞衰老标志物CDKN1A（p21，D）、CDKN2A（p16，E）和增殖标志物MKI67（F）的相对表达。G，衰老聚类低组和高组中健康对照组（HC，n = 5）、轻度/中度哮喘患者（MMA，n = 17）和严重哮喘（SA，n = 16）参与者的相对百分比。对类别变量进行了Fisher确切性检验以进行比较。对2组之间的数值变量进行了Wilcox秩和检验。 p <0.05被视为统计学显著性。

气道CD206+巨噬细胞显示衰老普遍性较低但细胞因子增加。

• A，密度散点图显示了用于细胞类型注释的标记物相对表达的分布。
• B，使用表面标记基因的组合注释了总共7个不同的细胞簇。
• C，衰老聚类低组和高组中每种细胞类型的相对百分比。
• D，IMSA队列中衰老聚类低组和高组BAL液中细胞因子水平。
• E，热图表示衰老聚类低组和高组CD206+巨噬细胞的细胞因子表达。基于Limma的多元线性回归用于衰老高组和低组之间丰度和表达的比较。 p <0.05被视为统计学显著性。

ACO患者肺泡巨噬细胞中的差异表达基因和途径。

• A，所有单核细胞/巨噬细胞的轨迹估计的二维散点图。
• B，通过Leiden匹配轨迹分析鉴定的细胞簇的分布。
• C，通过组匹配轨迹分析，细胞层的分布。
• D，常用于单核细胞/巨噬细胞的谱系标记物的相对表达。
• E，通过FindMarkers鉴定的7个细胞簇中排名靠前的高表达标记基因。
• F，Leiden簇1和其他簇之间的AUCell KEGG富集评分差异。
• G，ACO组和对照组之间的SenMayo衰老评分差异。
• H-I，ACO组和对照组中细胞衰老标志物CDKN1A（p21，H）和CDKN2A（p16，I）的相对表达。
• J，代表与氧化还原酶、细胞因子和生长因子相关的基因在ACO组和对照组之间的差异表达的热图。
• K，Leiden簇1中CDKN1A表达与差异表达基因和单核细胞/巨噬细胞谱系标记物之间的相关性。对比较两组之间的数值变量使用Wilcox秩和检验；对于计算缺失表达值之间的系数使用Pearson相关性。 p <0.05被视为统计学显著性。

PPARγ作为调节肺泡巨噬细胞细胞衰老的关键因素。

• A，hdWGCNA分析确定了六个基因模块，重点关注Leiden簇1。
• B，棕色模块与ACO组和对照组之间细胞衰老差异呈正相关。
• C，具有高相关性的棕色模块中的前30个中心基因。
• D-F，通过WikiPathways（D）、Reactome（E）和KCGG（F）鉴定了棕色模块中的不同途径。
• G，由PySCENIC生成的得分值排名Leiden簇1的前10个特定调控元。
• H，针对TRRUST数据库进行的棕色模块内的转录因子富集分析。

小结

• 主要数据及方法：

Types	Notes
分析数据	Bulk：GSE136587，FR-FCM-Z395（Flow Repository数据库）
单细胞分析方法	Seurat标准流程；LibraR包差异分析；AUCell富集评分；hdWGCNA共表达网络；PAGA轨迹分析；PySCENIC转录因子后TRRUST作富集；
Bulk分析方法	ConsensusClusterPlus一致性聚类；limma差异分析
CyTOF分析方法	和scRNA大同小异，归一化用CATALYST，聚类用FlowSOM，diffcyt鉴定差异细胞丰度和细胞因子表达，然后还是limma找差异
可视化	除了Py和R，GraphPad也用上了，然后R包：genekitr、ggVennDiagram、ComplexHeatmap这些