生信分析矫正P值_万字长文+诚意满满 | 单细胞转录组分析最佳思路综述

 今天是生信星球陪你的第618天

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   大神一句话，菜鸟跑半年。我不是大神，但我可以缩短你走弯路的半年~

   就像歌儿唱的那样，如果你不知道该往哪儿走，就留在这学点生信好不好~

   这里有豆豆和花花的学习历程，从新手到进阶，生信路上有你有我！

刘小泽写于2020.5.6-5.8

历时三天，终于理解完！不仅仅是综述，更不是纯翻译文，而是将其中重要的知识点和之前个人所学结合起来”一阳指和狮吼功合并为一整招“
最后，强烈建议打开原文链接，因为所有文献都是有链接的，可以直接点进去

1 文章信息

题目：Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial

发表日期：2019年6月19日

杂志：Mol Syst Biol

文章在：https://www.embopress.org/doi/10.15252/msb.20188746

DOI：https://doi.org/10.15252/msb.20188746

图1

2 摘要

单细胞领域日新月异，大量的工具被开发出来，但很难去判断是否好用，而且如何组建一个分析流程是一个难点。本文将详细介绍单细胞转录组数据分析的步骤，包括预处理(质控、归一化标准化、数据矫正、挑选基因、降维)以及细胞和基因层面的下游分析。并且作者将整个流程应用在了一个公共数据集作为展示(详细说明在：https://www.github.com/theislab/single-cell-tutorial)，目的是帮助新入坑用户建立一个知识体系，已入坑用户更新知识体系。

3 前言

需要注意，虽然在原文链接中这些文献链接可以打开，但会链接到原文的该文献位置，而不是直接打开该文献

现在已经可以利用scRNA研究斑马鱼、青蛙、涡虫的细胞异质性(Briggs et al, 2018; Plass et al, 2018; Wagner et al, 2018) ，重新理解以前的细胞群体，但这个领域面临的一个问题就是没有成熟的标准化流程。标准化之路的困难有：大量分析方法和工具的诞生(截止2019.3.7 已经有385种工具)、爆炸式增长的数据量(Angerer et al, 2017; Zappia et al, 2018)。另外根据不同研究目的，各种分支也突显，例如在细胞分化过程中预测细胞命运(La Manno et al, 2018)。在我们眼界大开的同时，分析流程标准化就变得更加困难。

在未来分析流程标准化之路上，困难还会存在于技术整合层面。比如现在大量的scRNA工具都是用R和Python写的，跨平台分析需求在增长，而对编程语言的喜好也决定了工具的选择。很多好用的分析工具将自己限制在用各自的编程语言开发的环境中，例如Seurat、Scater、Scanpy。

接下来，就一起看看作者列出了哪些他认为比较好的软件和流程吧

先上一个scRNA分析总体流程图：

图2

4 预处理和可视化

4.1 首先看一下实验过程

比较详细的介绍可以看：Ziegenhain et al (2017); Macosko et al (2015); Svensson et al (2017).

原文描述的关键点是：

• 4步走：Typical workflows incorporate single‐cell dissociation, single‐cell isolation, library construction, and sequencing.
  组织裂解=》细胞分离=》文库构建=》测序

• 第一步：As a first step, a single‐cell suspension is generated in a process called single‐cell dissociation in which the tissue is digested.

• 第二步：To profile the mRNA in each cell separately, cells must be isolated. 写了主要的2种方法：plate‐based、droplet‐based，当然也都存在一些问题：In both cases, errors can occur that lead to multiple cells being captured together (doublets or multiplets), non‐viable cells being captured, or no cell being captured at all (empty droplets/wells)

• 第三步：Each well or droplet contains the necessary chemicals to break down the cell membranes and perform library construction. Furthermore, many experimental protocols also label captured molecules with a unique molecular identifier (UMI).

UMI的作用主要是区分：UMIs allow us to distinguish between amplified copies of the same mRNA molecule and reads from separate mRNA molecules transcribed from the same gene.

• 第四步：Libraries are labelled with cellular barcodes and pooled together (multiplexed) for sequencing.

感觉原文描述的还没有illumina给出的详细，那么就看看illumina的图文并茂版：

illumina单细胞测序工作流程：关键步骤和注意事项：http://web.illumina.com.cn/landing/products_view.asp?newsid=324

图3

图4

原始测序数据要经过处理得到表达矩阵，注意这里有两种表述方式：molecular counts (count matrices) 【也即是使用UMI的】和 read counts (read matrices)，取决于是否使用UMI。而作者介绍的流程中，默认使用 count matrices，除非readmatrices和  count matrices得到的结果存在差异，才会特别介绍read matrices

关于比较read and molecule counts，有人写了一个R流程：https://jdblischak.github.io/singleCellSeq/analysis/compare-reads-v-molecules.html

原始数据处理工具主要有：CellRanger、indrops、SEQC、zUMIs

它们主要做了这么几件事：

• read quality control (QC)

• assigning reads to their cellular barcodes and mRNA molecules of origin (also called “demultiplexing”)

• genome alignment

• quantification

得到的矩阵行是转录本，列是barcodes【这里用barcodes而不是直接叫细胞，是因为不同细胞的reads也可能属于同一个barcode =》如果出现一孔/液滴多细胞(doublet情况)，那么barcode在多个细胞都是一样的】当然也会出现有barcode但实际没有细胞的情况(一个孔/液滴没有细胞即droplet，但这个孔/液滴也会赋予barcode)

反正记住：barcode和孔/液滴是对应的，但一个孔/液滴中有一个细胞还是多个细胞或者没有细胞，都会存在barcode。只不过最后可能会看到：多个细胞对应一个barcode、即使没有细胞也会有barcode这样的情况

关于10X实验环节，可以看我之前写的：知根知底才能有的放矢

图5

4.2 质控<