2020.10.14丨ISO-Seq分析

• Sequel II 平台介绍
  • 零模波导孔(ZMW)：是Sequel II平台的最小测序单元，每个SMRT cell包含800万个零模波导孔。测序时，落入孔中的序列会被反复读取，每读取1次得到1条subread，即一个ZMW中的所有subreads来源于同一条转录本
  • subread(子序列): 是ploymerase read去掉接头（adapter）后的序列。每个ploymerase read可以分割成一个或多个子序列(subread)，图中共有3条subreads，其中full passes的subreads数有2条
    • 图示
  • CCS read(circular consensus sequencing，环形一致性序列): 通过对同一个ZMW中的subreads使用CCS算法分析得到。（产生的CCS read不需要与参考序列比对）
    • 图示
  • 交付数据文件
    • 图示
  • 下机结果
    • 图示
• Iso-Seq分析流程
  • 定义：Iso-Seq , 全称叫做 Isoform-sequencing，是利用三代测序长读长的特点，不需要打断转录本，直接测序，从而得到全长转录本的一种测序技术。
  • 分析目的：从PacBio原始数据得到高质量转录本序列。
  • 分析步骤：
    • 1）Generate CCS（ccs）
    • 2）Classify full-length reads（lima）
    • 3）isoseq3 refine
    • 4）isoseq3 cluster
  • 分析工具：
    • SMRT Link v8.0
    • 下载地址：：https://downloads.pacbcloud.com/public/software/installers/smrtlink_8.0.0.80529.zip
  • step1：Generate CCS
    • 分析命令：ccs --min-passes 3 --min-length 50 --max-length 15000 --min-rq 0.99subreads.bam ccs.bam
      参考网址：https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq_SA3nUP/wiki/Tutorial:-Installing-andRunning-Iso-Seq-3-using-Conda
  • step2：Classify full-length reads
    • 分析命令：lima --isoseq --dump-clips --peek-guess -j 8 ccs.bam primers.fasta fl.bam
  • step3：isoseq3 refine
    • 分析命令：isoseq3 refine --require-polya --min-polya-length 20 -j 4 fl.primer_5p--primer_3p.bamprimers.fasta flnc.bam
  • step4：isoseq3 cluster
    • 分析命令：isoseq3 cluster flnc.bam polished.bam -j 8 --verbose --use-qvs