从零开始学PCR技术（四）：常见问题

PCR 反应可能存在问题，比如无扩增条带、有扩增条带但是假阳性、出现非特异性条带或者条带出现拖尾现象，这是因为 PCR 反应存在多个关键环节：1、模板核酸的制备；2、引物的质量与特异性；3、酶的质量；4、PCR 循环条件。任何一个环节出现差错都会导致 PCR 失败。

PCR 常见的四种问题

问题一：假阴性

现象：无扩增条带。

原因：

1.模板

• 模板中含有杂蛋白质、Taq 酶抑制剂，模板上样量低或模板降解；

• 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

• 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

2.引物

• 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;

• 有些批号的引物质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增;

• 对策：① 选定一个好的引物合成单位。② 引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

3.酶

• 酶失活，需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。

4.Mg2+浓度<