宏基因组组装揭示养殖动物粪便及堆肥中常见抗生素耐药基因的宿主及可转移特征
Metagenomic Assembly Reveals Hosts and Mobility of Common Antibiotic Resistome in Animal Manure and Commercial Compost
Article，2022-08-11， Environmental Microbiome, [IF 6.36]
DOI：https://doi.org/10.1186/s40793-022-00437-x
原文链接：https://environmentalmicrobiome.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40793-022-00437-x
第一作者：Tianlei Qiu (仇天雷)
通讯作者：Guiming Liu (刘贵明)；Xuming Wang (王旭明)
合作作者：Linhe Huo (霍琳贺); Yajie Guo (郭雅杰), Min Gao (高敏), Guoliang Wang (王国良), Dong Hu (胡栋), Cheng Li (李成), Zhanwu Wang (王占武)
主要单位：
1. 北京市农林科学院生物技术研究所
(Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Institute of Biotechnology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, People’s Republic of China)
2. 河北省农林科学院资源环境研究所
(Institute of Agro-Resources and Environment, Hebei Fertilizer Technology Innovation Center, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang, 050051, Hebei, People’s Republic of China)
3. 北京市农林科学院质量标准与检测技术研究所
(Institute of Quality Standard and Testing, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, People’s Republic of China.)
- 摘要 -
背景
集约化养殖中的抗生素和抗生素耐药基因（ARGs）污染威胁着全人类健康；然而，不同动物粪便和混合粪便堆肥中核心抗生素抗性组及其可转移性和宿主特征仍不清楚。本研究中，我们利用宏基因组组装和跨样本映射解析了畜禽粪便和堆肥中常见抗性组及其潜在的可移动性和宿主特征。
结果
有 201 个 ARGs 为不同动物（蛋鸡、肉鸡、猪、肉牛和奶牛）粪便中共有，它们占 ARGs 总相对丰度的 86-99%。除多耐药类、磺胺类和甲氧苄啶耐药基因外，堆肥产品中大多数 ARGs 的相对丰度显著低于动物粪便。Procrustes 分析表明，粪便中抗生素浓度与ARGs丰度呈正相关，但堆肥中两者不相关。在我们的样本中，超过 75% 的 ARGs 亚型在质粒和染色体之间共有。转座酶在介导ARGs 在不同细菌门之间的转移中发挥关键作用。对携带 ARGs 的 contigs跨样本mapping表明，粪便中常见抗生素抗性组的宿主对动物物种有所偏好，并且优势ARGs宿主菌属由粪便中的肠球菌变为堆肥中的假单胞菌属。广宿主范围和与多种移动遗传元件 (MGEs) 相连是在堆肥后得以存活的ARGs的两个关键特征，例如 sul1 和 aadA。多耐药基因是养殖粪便中致病性耐药细菌的主要 ARGs类型，但能够通过堆肥得到有效控制。
结论
我们的研究揭示了养殖动物粪便中的常见抗生素抗性组，对ARGs 宿主进行了分类和相对定量分析，并评估了ARGs的可转移能力。堆肥过程可以通过改变细菌宿主来消减动物粪便中的ARGs；而由于多样的宿主范围和MGEs的存在，部分ARGs 能够在堆肥后存活。我们的研究结果为畜禽养殖中ARGs 的来源跟踪、风险评估和控制提供了科学基础。
- 引言 -
自 1950 年美国食品药品监督管理局首次批准以来，为了促进生长、预防或治疗动物疾病，抗生素被广泛用于动物养殖。在中国，畜禽养殖每年消耗大约 162 000 吨抗生素，占抗生素总使用量的 52% 以上。这些抗生素中的大部分不能被动物有效代谢，导致粪便中大量残留，进而引发抗生素抗性细菌 (ARB) 和相关耐药基因 (ARGs) 的发展。越来越多的研究表明，畜禽粪便是 ARB、ARGs 和潜在的人类病原菌 (HPB) 传播的储存库。中国是全球最大的家禽和生猪生产国，年产畜禽粪便约38亿吨。粪便好氧堆肥是一种常用的粪污处理技术，可将复杂的有机化合物分解成稳定的最终产品，用于农业土壤改良的有机肥料。以前的研究主要集中在单一动物粪便堆肥过程中ARGs的变化和潜在宿主。然而，在商业有机肥中通常使用混合原料而非单一粪源。因此，对不同动物粪便和商业堆肥中常见抗生素抗性组的研究可以揭示控制养殖中ARGs污染和传播的重要信息。
可移动遗传元件 (MGEs) 介导的水平基因转移 (HGT)，是环境中的ARGs得以富集和广泛存在的重要原因。动物粪便和堆肥过程中的 ARGs 和 MGEs 在多样性和丰度方面已得到充分证明；然而，不同粪便和商业堆肥的常见抗性组和可移动 ARGs 特征仍有待阐明。细菌群落是堆肥过程中影响 ARG 谱的关键因素，明确 ARGs 宿主有利于控制粪便堆肥过程中ARGs 的传播。潜在ARGs宿主细菌的鉴定和定量通常基于相关性分析，然而，由于 16S rDNA 扩增子测序并不包括 ARGs 信息，基于 ARG 和细菌共现性分析的量化可能高估了潜在 ARGs 宿主的相对丰度。直接对携带ARGs的contigs（ARCs）进行鉴定和相对定量分析可以为分析环境中的ARGs宿主提供另一种可行的方法。
在这项研究中，我们使用宏基因组组装结合 ARCs 的相对定量分析来建立 29 个农场和 13 个堆肥厂的 ARGs 库，揭示了 ARGs 宿主在混合原料堆肥中的变化。通过比较粪便和堆肥中的 ARGs 相对丰度，我们确定了动物粪便的常见抗性组及其堆肥后的变化。通过宏基因组组装和共定位分析，我们获得了 ARGs 和有关共定位基因的其他信息，以预测 ARGs 的可移动能力和毒力。基于所有样本的非冗余 ARCs 的跨样本映射用于量化 ARGs 宿主。
- 结果 -
不同养殖动物粪便中的耐药基因组成特征
ARG profile in manure from different animals
在来自 29 个农场的粪便样本中，检测到 20 种 ARGs，包括 626 个亚型；其中肉鸡粪中545，猪粪中427，蛋鸡粪中419，奶牛粪中288，牛粪中232。86.58%的ARGs属于前五种类型，即β-内酰胺、多耐药、大环内酯类、氨基糖苷类和四环素类耐药基因；这些类型占总 ARG 丰度的 74.29%（图 1a）。磺胺耐药基因仅有三个亚型，但它们占 ARG 总丰度的 6.68%。相比之下，β-内酰胺类耐药基因占总 ARG 数量的 55.11%，但它们仅占总 ARG 丰度的 3.47%。肉鸡粪便中总 ARGs 的平均数量 (311) 和相对丰度 (1.59)均最高。基于 PCoA 的 ARG 亚型相对丰度显示，肉鸡粪便中 ARGs 的分布与生猪中的更相似（图 1b）。由于奶牛粪便在所有样品中的抗生素残留量最低，奶牛粪便中的 ARGs构成与其他动物粪便中的不同。
图1 不同动物粪便中的抗生素耐药基因组成。
a. ARG 亚型的平均检测数量和相对丰度（由 16S rDNA 标准化）。b. 描述 ARGs 整体分布特征的主坐标分析 (PCoA)。
养殖粪便常见抗性组
Manure common resistome
有201 种 ARGs 亚型在不同的动物粪便中共有，主要包括多耐药 (46)、大环内酯类(30)、四环素类 (28)、β-内酰胺类 (26) 和氨基糖苷类 (25) 耐药基因，（图 2）。此外，这些亚型占粪便样本中总 ARG 相对丰度的大部分；蛋鸡 (98–99%)、肉鸡 (89–99%)、猪 (86–99%) 以及牛肉和奶牛 (> 99%)。我们将这 201 个亚型 ARG 定义为动物粪便中的常见耐药基因组。氯霉素外排泵基因在所有样品中有着最高的平均相对丰度（0.046），而在肉鸡粪便样品中的磺胺耐药基因 sul1 中检测到单个耐药基因最高相对丰度（0.25 个拷贝）（图 2c）。最广泛存在的 ARG 亚型为核糖体保护蛋白基因（tetW、 tetM）和氨基糖苷类失活基因（aadE）。氨基糖苷类核苷酸转移酶基因 (aadA)、链霉素磷酸转移酶基因 (AAC(6')-Ie/APH(2')-Ia、aph(3_)-I、aph(3)-I 和 aph(6)-I)， 大环内酯类 耐药基因（ermB 和 lnuA）在猪和鸡粪样本（图 2c，B 组）中占优势。与其他样品相比，肉鸡样品中多耐药外排泵基因的相对丰度显著高，如 mdfA、mdtD、mdtE、mdtF、mdtG、mdtK、mdtL、mdtM、mdtN、mdtP 和 mexX（图 2c，C 组）。相比之下，肉牛粪中四环素耐药基因（tetO、tetQ、tet32 和 tet40）和 β-内酰胺酶基因（cfxA2）（图 2c, D 组）相对丰度较高。
图 2 粪便常见抗性组中 ARG 亚型的维恩图和热图。
a. 维恩图展示了共有 ARG亚型的数量; b. 常见抗性组的组成; c. 常见抗性组 ARG（201 个 ARG 亚型中的 113 个）的热图，保留平均相对丰度大于 0.001 个拷贝/16S rRNA 基因。(A) 所有样本中的主要 ARG 亚型；(B) 除牛粪外的粪样中的主要 ARG 亚型；(C) 肉鸡粪便中的主要 ARG 亚型；(D) 肉牛粪便中的主要 ARG 亚型。
堆肥后常见抗性组的变化
Changes in the manure common resistome after composting
堆肥降低了粪便常见抗性组中主要 ARGs 的相对丰度；粪便中 ARGs 的总相对丰度（0.938 copies per 16S rRNA gene）显着高于有机肥中的（0.405 copies per 16S rRNA gene）（p = 0.0016）（表 S2）。然而，堆肥对三种类型（多药、磺胺和甲氧苄啶耐药基因）没有任何显著影响。大多数主要 ARG 类型的相对丰度，如氨基糖苷类、氯霉素、大环内酯类、四环素和 β-内酰胺耐药基因在堆肥中显著低于粪便（图 3a），而万古霉素耐药基因在有机肥中的相对丰度显着高于粪便。
此外，在 201 个常见的抗性组 ARGs 中，堆肥中 123 个 ARG 亚型的相对丰度显著降低，而堆肥中的其他 32 个 ARGs 亚型的相对丰度显著高于粪便。除了两个磺胺类药物（sul1 和 sul2）和一个氨基糖苷类（aadA）耐药基因外，堆肥中前 20 种 ARG 亚型的相对丰度显著低于粪便（图 3b）。在平均相对丰度 > 0.001 的所有 ARG 亚型中，只有 8 个 ARG，包括vanR、mutigrug_ABC_transporter 和 fosB，在堆肥中的相对丰度显着高于粪肥中的相对丰度（图 S4）。PCoA 显示大多数堆肥中的 ARGs 成分与粪便样品中的成分不同（图 3c）。
图3 堆肥后的粪便常见抗性组变化情况。
a.有机肥和堆肥之间的ARG类型的箱线图。b. 粪便和堆肥中前20个ARG亚型的平均相对丰度。星号“*”和“**”分别表示0.05和0.01的显著水平。主坐标分析(PCoA)描述了ARG亚型在粪便和堆肥之间的差异。
堆肥后抗生素残留与ARGs关系的变化
Changes in the relationship between antibiotic residue and ARGs after composting
在粪便样品中检测到 19 种抗生素，它们分为五类，即四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、苯酚类和另外两种（林可霉素和头孢噻呋）（数据集 1）。粪便中抗生素残留的平均总浓度为 96,937 μg/kg（肉鸡）、50,248 μg/kg（猪）、5321 μg/kg（蛋鸡）、858 μg/kg（肉牛）和 295 μg/kg（奶牛）。四环素是猪粪和肉鸡粪中的主要抗生素，分别占抗生素总浓度的96.28%和93.77%。此外，四环素类和喹诺酮类分别占蛋鸡粪肥中总浓度的55.99%和24.3%。喹诺酮类是牛粪中的主要抗生素，占抗生素总浓度的89.77%。
我们评估了粪便样品中 ARGs 和抗生素之间的相关性。在 12 种抗生素和 6 种 ARG 之间观察到显著的正相关（p < 0.05，r > 0.5）（图 4a）。该网络显示，大多数抗生素残留与多种 ARG 类型有关。粪便中的主要抗生素（四环素）与所有六种ARG类型均呈显著正相关，表明大量抗生素残留将直接导致动物粪便中抗生素耐药性增强。一些低浓度的抗生素也与几种 ARG 相关。头孢噻呋是一种治疗性抗生素，在粪便中的浓度很低（0-561.42 μg/kg）；但它与 37 种 ARG 亚型的显著相关性。Procrustes 分析证实，粪便抗性组与抗生素残留显著相关（图 4b）；但是，它们与堆肥后的抗生素无关（图4c）。这些结果表明堆肥可以减少堆肥中的抗生素残留并降低抗生素与耐药基因之间的相关性。
图4 ARGs与抗生素相关性分析。
a. 基于ARGs和抗生素共存的网络分析(r>0.5，p<0.05)。b. Procrustes 分析表明 ARG 亚型与粪便中抗生素之间的相关性。C. Procrustes 分析表明 ARG 亚型与堆肥中抗生素之间的相关性。（磺胺嘧啶（SDZ）、四环素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、强力霉素（DC）、泰乐菌素（TYL）、林可霉素（LC）、诺氟沙星（NFX）、恩诺沙星（EFX）、氟苯尼考（FF） , 头孢噻呋 (CEFT)).
耐药基因宿主菌群的变化
Changes in ARG bacterial hosts
总共从所有宏基因组中组装了 1200 个非冗余 ARC，包括 224 个 ARG 亚型。Proteobacteria 和 Firmicutes是主要宿主，分别占 ARC 的 50.08% 和 37.77%，而Bacteroidetes 和 Actinobacteria分别占 6.49% 和 5.24%（表 S3）。宿主细菌中包括条件致病菌，如Escherichia, Enterococcus, Klebsiella, Staphylococcus, Acinetobacter, Pseudomonas, Clostridium, Citrobacter, Streptococcus 和 Enterobacter（图 5a）。Enterococcus 和 Escherichia是优势属，分别占全部 1200 个 ARC 的 10.4% 和 10.23%。
此外，基于属水平ARCs的相对丰度（cpm）分析，表明氨基糖苷类耐药基因的主要宿主是Enterococcus, Streptococcus, 和 Enterobacter，而四环素类耐药基因的主要宿主是Pseudomonas, Lactobacillus和 Streptococcus。与其他样品相比，肉鸡和猪粪中六种主要ARGs的宿主cpm明显更高。Escherichia是多药耐药基因的主要宿主。堆肥中 ARG 宿主在属水平上的丰富度显著低于粪便样品中的丰富度（图 S7），而 ARG 宿主的Shannon 和 Simpson指数在粪便和堆肥之间没有表现出显着差异。
为了观察堆肥后粪便中ARG宿主组成的变化，根据相对丰度（cpm）计算宿主百分比（图5b）。根据ARCs的分类单元分类结果，我们发现宿主在门水平上会随着ARG类型的不同而变化。氨基糖苷类耐药基因主要分布在Firmicutes 和 Proteobacteria中；然而，两个携带氨基糖苷类耐药基因的门受到堆肥的影响；堆肥后，具有氨基糖苷类耐药基因的Firmicutes 和 Proteobacteria的平均百分比分别从14.58%下降到5.48%，从14.73%上升到18.55%。四环素耐药基因广泛分布在所有四个门中。此外，堆肥后其他三个门宿主中具有四环素耐药基因的百分比下降；然而，那些携带四环素耐药基因的Actinobacteria却未减少。Firmicutes主要携带大环内酯类耐药基因，而Proteobacteria携带磺胺、多药和甲氧苄啶耐药基因。值得注意的是，携带磺胺耐药基因的变形菌的百分比从粪便中的 6.41% 增加到堆肥中的 17.28%。
图 5 基于 contig 组装和量化的 ARGs 宿主分布。
a. 基于抗生素抗性重叠群（ARCs）上的ARGs和宿主物理连锁模式的网络分析。保留至少具有两条边的节点（ARG 或属）。根据 ARG 类型和宿主门对节点进行着色。b. 基于跨样本映射到ARCs的门水平细菌中ARG类型的分布。c. 大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类和磺胺类基因的主要宿主(每个样本中平均百分比最高的 10 个属)。
ARGs 在可移动遗传元件上的分布
Distribution of ARGs in mobile gene elements
总体而言，1200个ARG中有695个(57.92%)携带MEGs，包括质粒(43.68%)、转座酶(16.33%)、整合子(8.50%)和重组酶(3.08%)。此外，741个ARG位于质粒或染色体上，携带204个ARG亚型，可分为19个ARG亚型。在我们的样本中，75.98%的匹配ARG(155个亚型)在质粒和染色体之间共享，前20个相对丰度最高的ARG亚型(图3B)都由质粒和染色体共享(图S8)。其中氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、多粘菌素类等13种ARG亚型仅存在于质粒中，而36种ARG亚型包括β-内酰胺类、多药类、四环素类、万古霉素和大环内酯类耐药基因等11种ARG亚型，仅存在于染色体上。Circos图显示，质粒具有类似于染色体的ARC相对丰度(CPM)(图6)。氨基糖苷类和四环素类耐药基因在质粒和染色体中均占主导地位。染色体携带较多的多药耐药基因，而质粒携带较多的氯霉素和大环内酯类耐药基因。
图6 Circos 表示显示 ARGs 的分布。
a. 质粒和染色体上的 ARGs 分布；b. 与转座酶、整合子和重组酶连锁的ARGs的分布。
- 讨论 -
动物粪便和其他环境中 ARGs 的比较
Comparison of ARGs in animal manure and other environments
通过宏基因组分析在我们的样本中检测到 626 个 ARG 亚型，而在之前的研究中通过高通量 qPCR 检测到不同动物粪便中的 109 个 ARG 亚型。氨基糖苷类和四环素类耐药基因在人类粪便和动物粪便中含量丰富。与城市污水和人类粪便相比，动物粪便中的多药耐药基因较多，占ARGs总量的20.3%，而β-内酰胺耐药基因的相对丰度较低（3.47%）。畜牧业集约化导致鸡和猪的ARGs迅速增加。在低收入和中等收入国家，从 2000 年到 2018 年，耐多药细菌的百分比在鸡中从 0.15 增加到 0.41，在猪中从 0.13 增加到 0.34。这表明 ARGs 的分布通常与选择压力和时空条件有关。基于 PCoA 的总细菌和 ARG 宿主的相对丰度表明，蛋鸡和肉鸡粪便中总细菌的分布相似；然而，肉鸡粪便中 ARG 宿主的分布更接近猪粪中的分布。由于家畜使用抗菌促生长剂，抗生素的长期选择压力导致多重耐药菌的出现。
宿主群落结构决定 ARGs 的组成
ARG host community determines ARG composition
通过确定 ARG 宿主信息，可以控制细菌群落以限制 ARGs 的传播。此外，通过基于宏基因组组装的 contig，ARGs 可以直接连接到更具体的细菌宿主，而不是通过相关性分析。相关性分析主要揭示堆肥中的主要宿主门是Actinobacteria；然而，在我们组装的ARCs中，主要的 ARGs 宿主门是Proteobacteria（55.24%）。Actinobacteria在我们的堆肥中也表现出显着的相对丰度（51.71%）；但是放线菌宿主的相对丰度仅占所有 ARGs 宿主的 16.91%。这一现象表明大多数增加的Actinobacteria在堆肥后可能并没有携带ARGs。
抗菌促生长剂可对肉鸡肠道中多耐药E. coli的筛选施加压力；因此，在我们的样本中，E. coli携带最多样化的 ARGs，它也是肉鸡和猪粪中多药耐药基因的主要宿主（图 5c）。E. coli与各种农业系统中各种新兴的人类 ARGs 有关，例如养鸡场、养猪场、奶牛粪便和农业土壤。粪肥中另一个重要的 ARG 宿主是Enterococcus，它是肉鸡和猪粪中氨基糖苷类耐药基因和大环内酯类耐药基因的主要宿主。堆肥后，携带 ARG 的Enterococcus的相对丰度从 832 cpm 下降到 16 cpm。虽然Lactobacillus通常用作益生菌并且被认为对动物的肠道微生物群有益，但在肉鸡粪便样本中，Lactobacillus是四环素抗性和大环内酯类耐药基因主要宿主占。值得注意的是，堆肥后vanR的相对丰度显著增加，因为vanR与几种Actinobacteria有关，包括Streptomyces, Glutamicibacter, u_Micrococcales和一些耐热的厚壁菌属，如Bacillus（图5a）。
在与各种原料中，如猪粪、鸡粪、牛粪、下水道污泥和食物垃圾堆肥过程中，经常会发现磺胺或甲氧苄啶耐药基因的丰度保持不变或增加。以前的相关分析表明，磺胺耐药基因的增加与降温-腐熟阶段的优势菌株呈正相关，而且磺胺耐药基因也经常被发现与MGEs相关，如intI1或ISR1。这些结果表明，由于HGT，ARGS可能在其他菌株中保持不变。在我们的样本中，基于宏基因组分析，我们发现了两点可能是磺胺耐药基因逃脱堆肥去除的原因。1. 磺胺类耐药基因宿主多样（宿主范围广）；sul1 由属于Proteobacteria, Firmicutes, 和 Actinobacteria的五个属携带（图 5a），包括Escherichia, Pseudomonas, Micrococcales, Pseudonocardia, Citrobacter, 和 Corynebacterium。堆肥后，假单胞菌取代肠杆菌和大肠杆菌成为磺胺类耐药基因的主要宿主。宏转录组序列和培养依赖性分析均发现假单胞菌在整个堆肥过程中是稳定的。这些结果表明，在堆肥过程中，sul1 可能会保留在耐热细菌中。2. 磺胺耐药基因与所有类型的 MGEs 连锁，包括质粒、整合子、转座子和重组酶。携带 sul1 的优势contig（J5k141_381193）的 cpm 位于Pseudomonas aeruginosa质粒上并含有 intI1 和 IS6100（图 S16）。共享的 MGEs 确保 sul1 有可能通过 HGT 在多个宿主中传播。另一种ARGs亚型是氨基糖苷核苷酸转移酶基因(aadA)，也有类似的情况。
粪便和堆肥中常见抗生素抗性组的基因转移潜力
Gene mobility potentials of common antibiotic resistomes in manure and compost
HGT 是通过 MGEs 在环境中传播 ARGs 的重要机制，例如质粒、整合子和转座子。目前的相关性分析表明，MGEs是堆肥过程中消除ARGs的重要因素。在我们的样本中，前 20 个高相对丰度的 ARGs 都出现在质粒和染色体共有的ARC上（图 S8），堆肥后大多数存活的 ARGs 也都由共享的 ARCs 携带（图 S9）。质粒可以帮助耐药细菌与其他菌株共享其 ARG，而移动和接合质粒对于在细菌群落中传播 ARG 特别重要。在我们的样本中，204 个已鉴定的 ARG 亚型中的大多数（75.98%）与质粒和染色体之间的共享ARC有关。这一结果不同于牛粪富集和宏基因组分析的结果，表明大多数ARGs存在于染色体上，也不同于质粒携带的ARGs在污水和废水处理厂宏基因组分析中占优势的结果。多耐药基因，特别是主要的促进超家族抗生素外排泵基因，存在于肠杆菌科如Escherichia 和 Klebsiella中。这些细胞壁/膜/包膜生物发生功能的基因通常由染色体而非质粒携带，因此移动能力较低可能导致它们在堆肥后可以有效去除。氯霉素外排蛋白基因是多药耐药基因；然而，所有携带 ARCs 的氯霉素外排蛋白基因都与我们样品中的质粒相关联。尽管堆肥后氯霉素素外排蛋白基因的相对丰度显着下降，但仍显示所有 ARGs 亚型的平均相对丰度较高。然而，MGEs 并不是 ARGs 逃避堆肥的唯一原因。万古霉素耐药基因 (vanR) 的相对丰度与任何 MGEs 都不相连，仅存在于染色体上，由于其 15 个宿主中包括嗜热放线菌 (Thermobispora) 和耐热厚壁菌门 (Bacillus)，导致其在堆肥后显着增加（表 S5）。
对携带MGEs 的 ARCs分类注释表明 ，转座酶、整合子和重组酶相关 ARCs 的主要宿主菌属于不同的细菌门。大多数与整合子相关的 ARCs 属于变形菌门，这表明整合子主要贡献于变形菌门中的ARGs水平基因转移。转座酶连锁的 ARCs 包括所有四个细菌门；江等人报道，变形杆菌病原体可以通过转座子和接合质粒从放线菌中获得 ARGs，宏基因组分析显示，大多数（63.2%）最近在质粒和细菌染色体之间转移的 ARGs 可归因于插入序列（IS）。转座酶由 IS 编码，在我们的样本中，14.53% 的 ARCs 携带具有 18 种 ARGs 类型的转座酶 (IS)，而 7.52% 携带具有 13 种 ARGs 类型的整合子元件。因此，转座酶（ISs）在介导动物粪便和堆肥中不同细菌门之间的 ARGs 水平基因转移中发挥关键作用。
与基于read分析相比，基于组装的分析会丢失一些低丰富度的 ARGs。在我们的样本中，所有组装的 ARCs（>500 bp）涵盖了 224 个 ARGs 亚型，仅占所有 626 个 ARGs 亚型的 35.8%，但能占粪便常见抗性组的 ARGs 亚型的 72.6%，即可以覆盖动物粪便多数的常见抗性组。
文中采用的宏基因组分析流程如下图（图S1）。
图 S1 本研究中的宏基因组分析工作流程.
参考文献
Kunkun Fan, Manuel Delgado-Baquerizo, Xisheng Guo, Daozhong Wang, Yong-guan Zhu & Haiyan Chu. (2020). Biodiversity of key-stone phylotypes determines crop production in a 4-decade fertilization experiment. The ISME Journal, doi: https://doi.org/10.1038/s41396-020-00796-8
- 作者简介 -
第一作者
北京市农林科学院
生物技术研究所
仇天雷
博士，副研究员
第一作者：仇天雷，博士，北京市农林科学院生物技术研究所 副研究员。2018-2019年美国密歇根州立大学访问学者。目前主要关注研究领域为畜禽粪便中抗生素及耐药基因污染处理。主持国家重点研发计划子课题、北京市自然科学基金委面上项目、北京市优秀人才等项目7项。以第一作者（或通讯作者）共发表论文15篇，其中6篇SCI。
通讯作者
北京市农林科学院
刘贵明
博士，研究员
通讯作者：刘贵明，生物信息学博士，北京市农林科学院研究员。研究方向为围绕高通量测序平台的检测和分子育种共性技术开发、组学大数据挖掘、复杂作物基因组的组装策略和方法、作物组学数据构建以及作物表观遗传调控等方面的研究。搭建了北京市农林科学院高性能计算平台和高通量测序平台，开发基于微流控和荧光定量PCR技术的高通量、多通道的快速核酸检测平台，可用于食源性致病菌快速鉴定系统、呼吸道病原体检测系统和植物疫病的快速检测，开发基于高通量测序的高通量、低成本目标区域捕获技术(超多重PCR和液相捕获)和数字PCR精准检测在动植物分子设计育种中的应用。建立了de novo、重测序、转录组、甲基化、lncRNA 和miRNA建库平台以及ATAC-seq、RNA m6A修饰、dCAS9捕获、Hi-C、ChIP-seq和等基于高通量测序的表观调控技术，开发植物单细胞测序技术研究。主持国家自然科学基金2项，主持国家科技基础性工作专项子课题1项。在Nature Genetics等杂志发表文章20多篇。
北京市农林科学院
生物技术研究所
王旭明
博士，研究员
王旭明，博士/研究员，北京市农林科学院生物技术研究所所长，中国农业生物技术学会常务理事、微生物生物技术分会常务理事，现代农业产业技术体系北京市创新团队岗位专家。主要从事农业环境微生物组和抗生素抗性组等方面的研究工作。近年来主持国家自然科学基金、北京市自然科学基金、北京市科技计划等科研课题20余项。发表科研论文100多篇。获省部级科学技术奖4项、农业技术推广奖2项。
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- 广纳英才-
王旭明课题组主要研究环境中新兴污染物——生物气溶胶、抗生素耐药基因的污染特征、迁移机制和控制策略，以及农业微生物组和环境微生物资源的开发利用。目前，课题组在研项目包括国家自然科学基金3项、北京市自然科学基金2项、北京市其他项目和院级项目4项。
课题组长期招聘相关专业的博士后和客座研究生，主要从事环境抗生素抗性或植物-微生物互作方向的研究，欢迎有志于进行相关研究的优秀人才加入团队，课题组将提供一流的科研条件（博士后招聘和相关待遇见官网：https://www.baafs.net.cn/index/noticeDetails?id=101）。
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