ISME | 西湖鞠峰组-污水处理厂中粘细菌的活跃捕食特性和多样性与全球分布规律...-CSDN博客

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导读人：王婧、黄昕瑜校稿人：张璐、鞠峰

论文

原名：Active Predation, Phylogenetic Diversity, and Global Prevalence of Myxobacteria in Wastewater Treatment Plants

译名：污水处理厂中粘细菌的活跃捕食特性、系统发育多样性和全球广泛分布

第一作者：张璐

通讯作者：鞠峰

作者单位：西湖大学

期刊：The ISME Journal

发表时间：2023

摘要

活性污泥是全球应用最广泛的废水生物处理技术，其中的微生物相互作用，驱动着污染物的降解与转化。研究微生物捕食对于深入理解微生物互作如何影响活性污泥中微生物组的构建和功能实现至关重要。然而，目前我们对活性污泥中捕食性细菌的多样性、捕食活性和生态功能知之甚少，这限制了基于微食物网互作的污水处理微生物组工程技术的开发。已报道对活性污泥中捕食性细菌的认知主要来源于少量蛭弧菌门（Bdellovibrionota）的细菌菌株。本研究利用RNA-稳定同位素探针技术（stable isotope probing, SIP），使用¹³C标记的猎物细菌（代表性肠道细菌和脱氮功能细菌），发现了多种尚未培养的捕食性细菌。其中，粘细菌（Myxococcota），尤其是Haliangium属和mle1-27分支的粘细菌，是污水处理厂中最主要的活跃捕食性细菌，而不是蛭弧菌。研究同时发现，与以纤毛虫为代表的捕食性原生生物相比，捕食性细菌表现出更强的捕食选择性。基于对本地污水处理厂活性污泥微生物组的长期监测，粘细菌丰度（6.5±1.3%）远高于蛭弧菌（1.0±0.2%），而且这一趋势在全球污水处理厂中普遍存在（5.4±0.1% vs. 1.1±0.0%）。此外，关联分析表明捕食性细菌对污水处理工艺效能存在潜在影响。系统发育分析揭示了活性污泥中丰富的粘细菌多样性和污水处理系统的生境过滤效应。综上所述，本研究极大拓展了对活性污泥中细菌间捕食关系的认知，发现了活性污泥中粘细菌的捕食活性、多样性和在全球范围的广泛分布，为利用捕食关系调控微生物组的工程应用提供了重要启示。

研究背景

活性污泥中存在细菌、真菌、原生动物和病毒等多种生物，是一个复杂的人工生态系统。捕食是一种重要的微生物间相互作用，对活性污泥工艺效能有重要影响。不同于对原生生物和噬菌体已有较为系统的认知，活性污泥中的捕食性细菌还未引起重视，现有对它们的捕食活性、多样性和环境分布的了解十分有限。细菌间的捕食在土壤等其他生态系统中被认为是微生物群落动态的重要生物驱动因素。目前已知的捕食性细菌主要来源于蛭弧菌门（Bdellovibrionota）和粘菌门（Myxococcota）。蛭弧菌在陆地和水环境中均有分布，而粘细菌主要存在于土壤中。已有研究报道从污水处理系统中分离出蛭弧菌类生物（Bdellovibrio-and-like organisms，BALOs）并发现它们能够调节污泥微生物群落结构。尽管粘细菌逐渐被发现存在于污水处理系统中，它们在其中的功能仍然未知。此外，基于菌株分离培养的方法可能远远低估了活性污泥中捕食性细菌的多样性。本研究采用了稳定同位素探针技术（stable isotope probing, SIP），利用¹³C标记的猎物细菌原位识别活性污泥中的捕食性微生物，并结合本地污水厂微生物组的长期监测和全球活性污泥微生物组数据集的分析揭示了捕食性细菌的多样性和生态功能。

研究方法

🔹利用¹³C标记猎物细菌的微宇宙实验和RNA-SIP

实验用活性污泥取自杭州市某市政污水处理厂（WWTP01）的好氧池，将¹³C标记的大肠杆菌Escherichia. coli ESS5和恶臭假单胞菌Pseudomonas. putida ESE1作为猎物细菌加入活性污泥中培养。设置对照组，添加未标记，即¹²C猎物细菌。实验共持续8天，分别在培养16小时、1天、2天、4天和8天后取污泥样品保存于−80 °C。

从污泥样品中提取RNA，加入CsTFA中配制密度梯度混合液并置于密封管中，在日立CP100NX超速离心机的P65VT2转子中以125 000 g_av 离心约64小时后分层收集各密度梯度区带，对各区带测定折光率，回收RNA并进行16S rRNA基因的qRT-PCR分析。选择重组分（密度1.851-1.872 g/mL）和轻组分（密度1.805-1.819 g/mL）的RNA反转录为cDNA，对原核生物16S rRNA基因V3-V4区和真核生物18S rRNA基因V4区进行扩增子测序分析。

通过计算各微生物属或ASV（Amplicon sequence variant）的富集因子（enrichment factor，EF）鉴别捕食了¹³C标记E. coli 和 P. putida的微生物。

🔹本地污水厂活性污泥的采样和分析

为了揭示在微宇宙实验中发现的捕食性细菌的原位丰度，本研究从WWTP01的好氧和厌氧池采集污泥样品，每季度采样，持续2年，污泥样品提取DNA并进行16S rRNA基因V3-V4区和全长的扩增子测序。

🔹粘细菌和蛭弧菌的系统发育分析

为表征粘细菌和蛭弧菌的多样性，将本研究中获得的粘细菌和蛭弧菌的16S rRNA基因全长序列与从MiDAS数据库获得的序列结合，并进行系统发育分析。

🔹全球活性污泥微生物组数据集的重分析

为了探究粘细菌和蛭弧菌在全球范围活性污泥中的分布，本研究获取了Global Water Microbiome Consortium已发表的全球269座污水处理厂活性污泥的16S rRNA基因扩增子数据集，并分析了其中粘细菌和蛭弧菌的丰度及与工艺条件和污泥效能的关联。

研究结果

粘细菌和蛭弧菌是活性污泥微生物中的活跃成员

原核16S rRNA测序表征的具有代谢活性的细菌群落结构在实验过程中变化不大（图1D和1E），但与基于DNA 测序分析推断的细菌群落（图1A和1B）呈现出明显差异。Myxococcota和Bdellovibrionota的16S rRNA基因转录本的平均相对丰度显著高于16S rRNA基因的平均相对丰度，表明它们是活性污泥细菌群落中的活跃组分，具有较高的代谢活性。真核18S rRNA基因和转录本的扩增子测序分析表明，¹³C-E. coli或¹³C-P. putida猎物细菌的加入并未引起真核生物群落结构的明显改变，纤毛虫（Ciliophora）是最主要的活跃真核生物成员。

图1. 添加¹³C标记猎物细菌的微宇宙实验中原核微生物群落的变化。（A-C）基于16S rRNA基因扩增子测序；（D-E）基于16S rRNA扩增子测序；（F）¹³C-E. coli和¹³C-P. putida在微宇宙实验过程中的矿化情况。

粘细菌是主要的捕食性细菌

微宇宙实验表明，无论在属水平（图2A）还是ASV水平（图2C）上，粘细菌的¹³C标记程度普遍高于蛭弧菌，且有多样性更高的粘细菌被标记。尤其，Haliangium属和mle1-27分支的粘细菌可能是主要的活跃捕食性细菌类群。被标记的捕食性细菌中大部分尚未被培养，例如mle1-27，VHS-B3-70和OM27分支。此外，捕食性细菌呈现出不同程度的捕食偏好（图2A和2C）。例如，蛭弧菌OM27分支仅在E.coli实验组中被标记（图2A和2C）。选择性捕食为利用捕食性细菌定向调控微生物群落及相应功能提供了基础。与之相反，原生生物对本研究使用的E. coli和P. putida并未呈现捕食的选择性。由此，本研究提供了捕食性细菌相较于原生生物更具有捕食选择性的原位实验证据。

图2. 基于rRNA在¹³C-重组分中的富集判别的标记细菌和真核生物。（A）细菌，属水平；（B）真核生物，属水平；（C）细菌，ASV水平；（D）真核生物，ASV水平。

污水处理厂中存在丰富多样的粘细菌和蛭弧菌

对本地污水处理厂（WWTP01）好氧和厌氧池中污泥的微生物组分析表明，粘细菌的相对丰度（6.5±1.3%）是蛭弧菌（1.0±0.2%）的5.7倍（图3）。微宇宙实验中发现的主要捕食性细菌Haliangium spp.的相对丰度最高，为2.8±0.7%。另有7个粘细菌属的相对丰度>0.1%，包括微宇宙实验中也被标记的未培养Polyangiaceae和mle1-27分支。蛭弧菌门只有Bdellovibrio属和OM27分支相对丰度>0.1%。此外，蛭弧菌在好氧污泥中的丰度（1.0±0.2%）高于厌氧污泥（0.6±0.1%；图3）。

图3. 本地污水处理厂的好氧和厌氧污泥中粘细菌和蛭弧菌的原位相对丰度。

基于对本研究中获得的和MiDAS数据库中的粘细菌16S rRNA基因全长序列的系统发育分析，Haliangiaceae和Polyangiaceae在全球污水处理厂中的多样性最为丰富（图4A），它们也是土壤中丰度和多样性最高的粘细菌科。值得注意的是，未培养的mle1-27分支也是活性污泥中粘细菌多样性的重要组分（图4A）。仅有约五分之一的粘细菌OTU（209/1010）与已报道从其他环境中分离的捕食性粘细菌16S rRNA基因序列相似性高于94.5%（属水平），表明活性污泥中存在大量未培养的粘细菌新物种资源。另外，活性污泥中的粘细菌与土壤等其他环境中的粘细菌在系统发育树上呈现区隔，表明了污水处理环境对粘细菌的生境过滤效应（图4C-E）。

图4. 全球污水处理厂中粘细菌的多样性。（A）基于16S rRNA基因全长序列的活性污泥粘细菌系统发育树；（B）与已报道从其他环境中分离的捕食性粘细菌16S rRNA基因序列相似性高于94.5%的活性污泥中的粘细菌OTU；（C-E）Haliangium属、mle1-27分支和Pajaroellobacter属的系统发育树。

粘细菌对全球污水处理厂污泥效能的潜在影响

粘细菌在全球污水厂的活性污泥中广泛存在，而且粘细菌的丰度（5.4±0.1%）普遍高于蛭弧菌（1.1±0.0%；图5A）。捕食性细菌的分布也存在一定的地域差异。例如，粘细菌和蛭弧菌在南美洲的平均相对丰度都最低（2.7±0.3%和0.7±0.1%；n=80），而分别在北美（6.5±0.2%，n=616）和非洲（1.5±0.1%，n=36）的相对丰度最高。此外，Haliangium在全球范围仍是粘菌门中丰度最高的属（2.4±0.1%），其次是mle1-27分支（0.5%±0.1%），这与本地污水处理厂的情况相似。Bdellovibrio是蛭弧菌门中丰度最高的属（0.4%；图5B）。

进一步分析捕食性细菌和污染物去除率的关联表明，Haliangium属与COD去除率呈显著正相关（r_s=0.16），与总磷去除率呈显著负相关（r_s=-0.12；图5B）。mle1-27分支与BOD、COD、氨氮、总氮和总磷去除率均呈显著正相关（r_s：0.13~0.31）。生态系统中捕食者的下行控制（top-down control）能够直接或间接影响群落的动态变化，从而捕食性细菌既能直接去除污水中的有害细菌，又可能通过缓解竞争压力等方式促进了功能细菌对污染物的降解转化。

图5. 粘细菌和蛭弧菌在全球活性污泥中的分布和对污泥效能的潜在影响。（A）取自不同国家的污泥样本中粘细菌和蛭弧菌的平均相对丰度；（B）与BOD、COD、氨氮、总氮和总磷去除率的相关性；（C-E）电导率和水力停留时间对Haliangium属和mle1-27分支粘细菌相对丰度的影响。

结论

本研究利用rRNA-SIP技术，结合微宇宙实验、本地污水厂的长期监测和全球数据集的深入分析，多尺度全面揭示了活性污泥中的捕食性细菌（尤其是粘细菌），这一以往被忽视的活性污泥微食物网的关键组分的多样性和捕食活性，极大拓展了对活性污泥微食物网的认知，为利用捕食性细菌定向调控活性污泥中的微生物过程提供了重要理论基础。

粘细菌是活性污泥中最重要的捕食性细菌，普遍存在于全球污水厂中，包括大量尚未被培养的物种资源。此外，本研究还证实了SIP技术在识别微生物食物网的关键参与者，揭示微生物互作模式，探究复杂环境中微生物生态学问题研究中的重要优势。

END

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环境微生物组学研究环境中全部微生物及其遗传信息，其方法学基础与理论拓展应用是国际学术前沿和热点。西湖大学环境微生物组与生物技术实验室开展环境工程学与微生物学交叉学科研究，研究兴趣包括：1）环境工程与合成微生物组学；2）微生物组的群落构建理论与功能原理；3）抗生素耐药性产生与传播机制及风险监控；4）持久性有机污染物（塑料与药物）降解转化及健康效应；5）废水处理中磷资源利用与回收。

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