mBio | 中科院南京土壤所孙波/梁玉婷组揭示跨界互作对稻田N2O排放的影响

微生物互作对稻田N2O排放及温度敏感性的影响

Microbial interactions related to N2O emissions and temperature sensitivity from rice paddy fields

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mBio [IF 7.786]

DOI:https://doi.org/ 10.1128/mbio.03262-22

原文链接:

https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/mbio.03262-22

第一作者:肖娴

通讯作者:梁玉婷 (ytliang@issas.ac.cn)

合作作者:Manuel Delgado-Baquerizo、申浩洋、马志远、周集中、孙波

主要单位:中国科学院南京土壤研究所、常州大学、巴勃罗·德·奥拉维德大学、东京大学、俄克拉荷马大学、清华大学、劳伦斯伯克利国家实验室

摘要

土壤微生物组驱动着陆地生态系统中的氧化亚氮(N2O)排放。从数万亿个土壤微生物中识别影响N2O排放的核心微生物群及其温度敏感性是一个巨大的挑战,这对提高与增温相关的土壤-气候反馈的可预测性至关重要。本文研究了包括古细菌、细菌、真菌、藻类和微型动物群在内的稻田土壤微生物群落,通过寻找核心物种对揭示了稻田N2O排放与其温度敏感性的潜在联系。结果表明,核心细菌与古细菌的组间互作和核心细菌的组内互作共同影响了N2O的排放及其温度敏感性。其中组间互作的贡献(32-33%)大于组内的贡献(10-18%)。这些结果表明,N2O排放及其对气候变暖的影响受土壤微生物组间和组内相互作用的影响。我们的研究结果有助于进一步了解微生物关键物种及网络互作在控制N2O产生及其对温度升高响应中的重要性。

引言

N2O是与全球变暖和臭氧消耗有关的最重要的分子之一,它可以在大气中停留一百多年。其中农业土壤中的N2O排放约占全球人为排放的50%。N2O产生和消耗的主要途径包括氨氧化、硝化细菌的反硝化作用、亚硝酸盐氧化、异养反硝化、厌氧氨氧化和硝酸盐氨化,其中硝化相关途径和异养反硝化是土壤生态系统N2O排放的主要来源。nirSnirK 和 nosZ 等反硝化基因丰度可以用来表征土壤中N2O的生物周转。先前的研究表明,高N2O排放速率中最多有68%可以由硝化菌和反硝化菌的丰度和多样性解释。然而,通过影响硝化菌和反硝化菌参与到N2O排放中的大部分复杂的生物和非生物过程现在尚不清楚。

首先,虽然硝化和反硝化是一种高度专化的N2O产生过程,但无机氮(如氨)的进入在一定程度上依赖于其他土壤过程,如有机质分解和矿化,这些过程是由高度多样化的土壤生物群驱动的。例如,据报道,共存的Thaumarchaea, 硝化螺旋菌(Nitrospira)和甲烷氧化菌(Methanotrophs)之间对氮的竞争会影响自养硝化作用。其次,微生物产生N2O的过程也可能是由土壤食物网内复杂的微生物相互作用驱动的。线虫和原生动物等微型动物通过捕食细菌或真菌促进土壤中氮的矿化,进而从微生物尸体中释放氮。除了以上提到的组间相互作用外,微型动物还可以进一步影响微生物组内相互作用的强度。例如,通过不加选择地捕食真菌来减少真菌之间的竞争,从而促进有机物的分解。由于耕作土壤中无机氮含量普遍较高,与微生物相互作用引起的氮利用率增加相比,微生物相互作用强度对N2O排放的影响可能更重要。此外,N2O排放对温度扰动非常敏感。人类活动造成农业地区温暖潮湿环境增加的趋势正在增加N2O的排放。而这些趋势又将通过气候变化的正反馈得到放大。水稻土壤增温试验表明,含nirS的反硝化菌对温度变化敏感,从而增加了土壤N2O排放。捕食者与猎物之间的关系也同样对温度敏感。例如,以真菌和细菌为食的线虫由于变暖而普遍增加。 

上述所有复杂性导致在解决核心生物相互作用和驱动N2O净排放以及减少N2O的关键过程方面面临挑战。网络分析已成为确定物种间关联和微生物之间的相互作用中整个群落变化的工具。Wagg等人通过使用网络分析提出了真菌和细菌群落内部和群落之间微生物的相互作用在影响和养分循环有关的多种生态系统功能方面的重要性。然而,我们对组内和组间微生物相互作用作为N2O排放的控制者的贡献却知之甚少。本研究对我国中温带、暖温带、亚热带和热带4个气候带(19.75°N to 47.58°N)中39个稻田429个土壤样品的古细菌、细菌、真菌、藻类和微型动物群的群落组成及参与氮循环的微生物功能基因进行了研究。稻田是温室气体排放的最重要的人为来源之一,土壤和水稻植株都向大气中排放N2O。通过对全国水稻土壤的采样,我们将环境因素的影响纳入了土壤核心微生物群的识别,因为沿气候梯度采样反映了较大的环境梯度,并覆盖了不同的土壤类型。通过构建土壤微生物群网络,并将组内/组间微生物群与N2O排放及其温度敏感性联系起来,旨在探索:(1)控制土壤N2O生产的核心微生物组及其温度敏感性;(2)微生物组间关联对稻田N2O排放的相对贡献。在本研究中,我们从多营养级土壤生物的角度提供了一种新的方法来识别N2O排放中的核心微生物群,并通过将核心微生物群与氮循环基因联系起来进行验证。

结果

稻田N2O排放潜力与温度敏感性

本文对39个稻田的429个土壤样品的N2O排放和温度敏感性进行了研究。亚热带和热带的N2O排放量和温度敏感性要高得多。多元线性回归表明,年平均气温(MAT)与N2O排放的相关性最强,高于土壤pH和有机碳等。N2O排放潜力与MAT之间的关系用指数回归拟合最好(r2 = 0.273, p = 0.0006, AIC = 117.0),N2O的温度敏感性也是如此(r2 = 0.296, p = 0.0001, AIC = 42.8)(图1)。Q10 值为T+10℃与T℃的通量比值,中温带为1.67 ± 0.54,暖温带为2.14 ± 0.54,亚热带为2.85 ± 1.43,热带为2.45 ± 1.78。通过方差分解分析,N2O排放变化中有46%可由气候因素、土壤属性和微生物多样性来解释。

利用GeoChip(图1C)检测了与N2O排放相关的硝化和反硝化过程中关键微生物功能基因的变化。氨氧化相关基因amoA的归一化信号强度在热带地区最低(p < 0.05, ANOVA, Tukey HSD)。参与反硝化作用的功能基因分析也显示出显著的地区差异。亚硝酸还原酶基因(nirS/K)和一氧化二氮还原酶基因(nosZ)在亚热带和热带更为丰富(p < 0.05, ANOVA, Tukey HSD);一氧化氮还原酶基因(cnorB)在暖温带最为丰富。硝酸还原酶基因(napA)在气候带间无明显变化。值得注意的是,从暖温带分离的样品在基因表达上存在很大的差异。

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图1. 中国主要水稻种植区水稻土壤N2O排放潜力和温度敏感性以及相关功能基因的变化

(a, b)N2O排放潜力(a)及其温度敏感性(b)均随稻田年平均温度(MAT)呈指数增长。直线表示最小二乘回归拟合,阴影区域表示95%置信限。(c)稻田土壤氮循环产生N2O的生物学过程以及相关基因的信号强度(包括amoA、hao、napA、nirK、nirS、cnorBnosZ)。中温带包括海伦、长春和沈阳;暖温带包括原阳和封丘;亚热带包括7个地区,临安、衢州、资溪、建瓯、长汀、衡阳和清新;热带地区包括1个地区,海口。每个基因的信号强度由所有检测到的基因的平均值归一化。柱状图中的不同字母表示不同气候区之间的显著差异(P < 0.05)。

土壤微生物组网络结构及其与N2O排放的关系

对中国北方和南方39个稻田429个土壤样品的微生物群落进行了分析。尽管稀释曲线仍在缓慢增,但测序深度总体能够覆盖每个微生物群落,因为数据集显示出较高的Good覆盖率估算值(98.48~99.34%)。土壤微型动物群丰富度由中温带向热带逐渐增加,而细菌和真菌的丰富度降低(p < 0.05, ANOVA, Tukey HSD)。 

在各稻田中建立了土壤微生物群落网络。不同气候带(图2a)土壤微生物群网络存在差异(图2a)。土壤生物主要类群之间的强相关性(Spearman’s rank correlation > 0.8)随着气候梯度的增加而增加(表1)。从北到南,网络收紧(network tightening),即连接百分比(percentage connectance)(节点成员之间所有可能的连接中强相关性的百分比)也显著增加。这种强烈的网络连接主要归因于细菌与古生动物的主要门和微型动物群(图2a)之间的联系,如EuryarchaeotaThaumarchaeota Nematoda。MAT与网络连接度的百分比呈显著相关(r2= 0.221, p = 0.005)。

土壤生物主要类群中分别有8个和10个(组间关联)与N2O排放潜力及其温度敏感性显著相关(P < 0.05)(图2bc)。特别是,它反映了线虫与土壤细菌、真菌、古菌(广古菌门Euryarchaeota)和藻类(链霉菌门Streotophyta、绿藻门Chlorophyta和杆菌菌门Bacillariophyta)的关系等组间调节的潜在作用(r = 0.35 ~ 0.60, P < 0.05)。此外,还发现了广古菌门与土壤微型动物之间相互作用的潜在贡献,如腹毛动物与轮虫之间的关联(r = 0.49 ~ 0.53, P < 0.05)。即使考虑到气候和土壤属性的影响,也保持了显著的相关性(表2)。然而,组内关联的连接很少与N2O排放相关。 

为了探讨每个气候带的采样数对观测结果的影响,我们从每个气候带中随机选择一个区域,重新分析了主要微生物类群相互作用强度与N2O排放之间的关系。然后重复这个过程。两个随机抽样的结果与上述发现高度一致,表明我们的发现对抽样数总体上是稳健的。 

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图2. 水稻土中主要微生物群相互作用强度及与N2O排放的关系

(a) 中温、暖温带、亚热带和热带水稻土中主要微生物群之间相互作用强度的网络可视化。(b,c)基于Spearman的相关性,主要微生物群互作强度与N2O排放潜势(b)及其温度敏感性(c)之间的相关性。主要类群在界水平(细菌和真菌)或门水平(古菌和真核生物)分类合并。相关性系数大于0.8的连线数与总连线数的比值为互作强度(连接度)。a中的线宽度与相关性系数大于0.8的连线数成正比,线颜色和透明度与互作强度成比例。节点的大小与该组中OTU数量成比例。“/”表示这两组之间没有相互作用。显著相关性用粗体表示。Ar,古细菌;Fa,微型动物;Al,藻类。

表1. 2013年6月至10月在中国水稻主产区的中温带、暖温带、亚热带和热带地区采集的稻田土壤的39个微生物网络的连通度

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表2. 中国水稻主产区稻田土壤主要微生物群互作强度与N2O排放潜力及其温度敏感性之间的Spearman相关性和控制了气候与土壤性质的偏相关性

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开发了两步识别潜在相关“核心”的方法

基于先前的理论框架,我们开发了一个两步标准来识别跨营养级的潜在“核心”(图3):首先,基于它们连接与N2O排放功能或其温度敏感性相关的其他微生物的潜力,对每个物种的功能关键性(Fi)进行评分。我们既考虑到一个物种在连接其他微生物方面的能力,也考虑到它们在功能方面的重要性。具体而言,通过考虑各物种对N2O排放的直接和间接影响,得出各物种对N2O排放的个体权重。然后,综合考虑各物种的作用以及两个核心物种之间的相容性,确定了功能最大化(Rij)的核心物种对。Rij指数是通过考虑一对物种如何共享相邻物种(合作效应)或它们如何相互回避(独立效应)来确定的,分别基于实际团聚度得分(Tij)和棋盘得分(checkboard score)(Cij)。详细的计算在材料和方法部分中给出。基于这两步标准,网络中的微生物可以被排序,来确定潜在的“核心”。 

结果表明,在最大化N2O排放潜力及其温度敏感性方面,组间物种的关联比组内物种的关联表现出更深刻的影响(表3)。在组间关联中,古菌与细菌的成对关联对N2O排放潜力和温度敏感性的贡献最大(Rij分别为2119284和1753863),其次是细菌与藻类之间的关联(Rij分别为92609和80040)。与其他土壤微生物类群相比,细菌组内关联对N2O排放潜力和温度敏感性的影响最大(Rij分别为40,292和169,637)。 

参与最大化N2O排放功能的前15个(组间)或10个(组内)关联最强的OTUs被确定为核心微生物群(图3b-c)。综合网络分析表明,古菌与细菌之间的相互作用以一种独立的方式吸引着邻近的微生物。古菌和藻类以合作的方式起主导作用。古菌似乎是连接界间相互作用的桥梁,促进强大微生物群落的形成,从而最大限度地促进土壤N2O的转化。有趣的是,核心微生物群与直接参与N2O生成和还原的氮循环基因(nirK, nirSnosZ)显著相关,r = 0.056 ~ 0.150, p < 0.05),表明它们对N2O排放的突出影响。

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图3. 两步法确定N2O排放潜力和温度敏感性的潜在核心微生物组

(a)首先评估每个物种与其他微生物之间的连接性对N2O排放潜力或其温度敏感性的的潜力,即物种功能关键性(Fi),对每个物种进行评分;然后,确定彼此之间形成了强大的促进性和相互作用,且进一步最大化相关功能的功能微生物对(Rij)。基于以上两步标准,可以对网络中的微生物进行排名,以提名潜在的核心物种。重要的是,我们在计算物种功能关键性时,通过考虑其他物种的直接和间接影响,评估了每个物种对N2O排放的权重。(b, c)考虑组内和组间互作的背景下,确定了影响N2O排放潜力(b)及其温度敏感性(c)的潜在核心微生物群。边的宽度与成对OTU的Rij指数成正比。蓝色边表示通过独立吸引功能微生物影响N2O排放最重要的前15个组内或前10个组间核心对。绿色边表示通过来协同吸引相邻功能微生物影响N2O排放最重要的前15个组内或前10个组间核心对。节点的大小表示OTU在核心微生物组中的连接度。

组间和组内互作对N2O排放的贡献

为理解土壤多营养生物群落的组间和组内互作对N2O排放的潜在贡献,我们绘制了一个概念示意图(图4)。有研究提出,非生物因素(如气候因素、土壤属性和农业实践)和功能微生物群解释了约59 ~ 68%的N2O排放变化。无法解释的部分可能或者部分归因于被忽视的微生物群相互作用。在这里,我们构建了跨土壤微生物组的整合网络,并将网络连接性等网络结构与N2O排放联系起来。然后,根据各物种的功能关键性,确定了使N2O排放功能最大化的核心物种对。最后,通过对最佳核心物种对的排序,推断出功能核心微生物群。根据该整合网络算法,我们发现网络连接以及组内和组间相互作用影响了N2O的排放。随机森林模型表明,组间互作对N2O排放和温度敏感性的贡献度分别为32.67%和31.87%(表3)。这远远高于组内互作,组内互作对其贡献分别为9.97%和18.32%。

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图4. 以整合网络视角探究微生物组互作对生态系统功能的潜在影响

在此,我们提出了一种整合网络视角算法,以研究微生物组相互作用对生态系统功能的潜在影响。首先,构建土壤微生物组的整合网络,网络结构(如网络连接度)与某些生态过程(如N2O排放)相联系。然后,基于每个物种的功能关键性(Fi),确定最大化功能(Rij)的最佳核心物种对。最后,通过对核心物种的最佳配对进行排序,可以推断出核心微生物群。通过使用整合网络视角算法,将网络结构和核心微生物群与N2O排放潜力及其温度敏感性的变化联系起来,我们发现,微生物组间互作(分别为32.67%和31.87%)对N2O排放潜力及其温度敏感性的贡献远远大于组内互作(分别为9.97%和18.32%)。

表3. 组间和组内土壤微生物互作对稻田N2O排放潜力和温度敏感性最大化的影响(Rija

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a 括号中的值是基于随机森林模型预测组间和组内互作对N2O排放解释的方差百分比。ND,在网络中未观察到两组之间的关联。

讨论

在耕作土壤中,我们观测到的N2O排放潜力为(0.25 ~ 21.83 μg NO2-N kg-1 d-1)与其他作者的测量结果一致,但总体上处于较低的排放水平。历史上气候较暖的稻田土壤比寒冷地区的稻田土壤具有更高的N2O排放潜力和温度敏感性。根据以往的研究,N2O排放量对于温度呈显著的指数相关(exponential temperature dependence)(r2 = 0.273 ~ 0.296)。此外,我们发现温度比土壤因素(如土壤pH)在影响N2O排放方面起着更重要的作用,尽管它们确实是之前报道的影响N2O排放的因素。N2O排放变化中无法解释的部分可能归因于,或至少部分归因于被忽视的微生物群的相互作用。 

土壤微生物组内和组间的相互作用共同决定了生态系统的功能。通过综合网络分析,我们的研究强调了稻田里与组内微生物相互作用相比,组间微生物相互作用在驱动N2O排放方面可能发挥更重要的作用。在这里,古菌成员(甲烷菌和未分类的Woesearchaeota)和细菌之间的相互作用对核心菌群的N2O排放贡献最大。这与我们的理解是一致的,古菌和细菌的联系可能是基于共营养氮循环,其中氨氧化古菌是氨氧化的主要驱动因素。虽然在Woesearchaeota中检测到氮循环基因nirK和nosZ,但对Woesearchaeota生态作用的研究发现,它们缺乏完整TCA循环的重要代谢途径。Woesearchaeota与细菌成员之间可能存在潜在的共营养关系,细菌可能提供氨基酸和其他化合物来补偿Woesearchaeota(图S7)的代谢缺陷。在我们的研究中,还发现细菌成员与甲烷微生物之间的相互作用可能会增加N2O的排放。尽管产甲烷古菌与其他微生物的相互作用是基于氢转移,但这种相互作用与N2O排放的理解仍有待进一步研究。研究结果还表明,细菌和藻类之间的相互作用对稻田土壤N2O排放的贡献仅次于细菌和古细菌。虽然在土壤中很少研究藻菌相互作用,但在废水处理中对藻菌生物膜的研究表明,细菌可以利用藻类(图S7)光合作用产生的O2分解有机物,从而为反硝化过程提供更多的电子供体。 

与组间相互作用相比,组内相互作用对N2O排放的贡献较小。在组内关系中,细菌成员间的关联对N2O的排放有较强的贡献。土壤细菌具有较高的功能多样性,编码了所有主要的微生物氮途径。在核心细菌成员中,厌氧杆菌属(Anaerosalibacter)与其他细菌成员一起在提高N2O排放潜力方面发挥了核心作用。厌氧杆菌可能是反硝化过程中的电子供体,因为它们在有机化合物的厌氧分解中发挥了主导作用(图S7)。Moorella sp.与其他细菌成员一起在提高N2O排放的温度敏感性方面发挥了核心作用。 Moorella成员可能直接影响N2O的产生,因为他们可以通过Flavodiiron蛋白来减少NO。 

此外,在沿气候梯度的稻田中,土壤微型动物的丰富度从中温带到热带逐渐增加,而细菌和真菌的丰富度逐渐降低(图S3b)。这样容易导致微型动物与细菌和真菌之间更密集的捕食者-被捕食者关系。我们的研究结果表明,线虫等微动物与其他微生物类群(细菌、真菌和藻类)之间联系的增加与N2O排放呈正相关。捕食土壤中微生物的动物的存在常常被证明通过刺激细菌活性间接增加氮矿化速率也通过排出氮化合物直接增加氮矿化速率。因此,线虫捕食最终将导致土壤中N2O排放量增加(图S7)。然而,我们的两步法没有检测到土壤微型动物(包括线虫)与其他土壤微生物之间有很强的关联性。这可能与检测方法有关,18SrRNA扩增子测序只能获得有限的土壤微型动物信息。另一方面,跨营养级的调节的作用没有体现在核心物种识别的权重中。通过增加营养信息(如捕食者比例)的重要性,可以将不同营养权重的影响参与到优先排序过程中。

结论

总之,我们使用网络分析来确定关键类群,这为真实生态系统中N2O排放的生态学提供了一个更全面的观点。具体而言,在温暖地区,微生物群网络的连接主要通过细菌与古菌亚群和微型动物群之间的强烈相互作用,对N2O排放潜力及其温度敏感性做出了积极贡献。核心微生物的识别考虑了它们的个体权重和对N2O排放的成对增强效应,其中组间相互作用强于组内相互作用。N2O排放潜力主要取决于细菌和古细菌的相互作用,其次是细菌和藻类的相互作用,而微型动物群似乎不那么重要。 

然而,在本研究中,使用基于相关系数的加权参数来识别关键类群有一定缺陷。相关性并不代表真正的权重,这是所有基于相关性的网络关系的共同问题。应更多地重视功能权重分配的生物学解释,如植物-微生物关联分析中的参考研究。此外,值得注意的是,利用高通量绝对定量测序或宏基因组的方法,将微生物类群的绝对丰度或相对丰度数据集用于构建微生物群网络更为合理。 

我们的研究结果对于预测全球N2O排放量和提出有效的生物缓解策略具有重要意义。首先,这项研究可能对改进陆地生物圈模型有一定的意义。在全球N2O模型相互比较项目(NMIP)中应用的大多数陆地生物圈模型中,通常使用Q10 来反映N2O排放的温度调节作用。在此,在模型中纳入微生物组的作用可能会提高N2O-气候反馈的可预测性。土壤微生物群的相互作用可以为早期的观察增加一个新的维度,即只有一些特定的类群作为N2O排放的驱动力。其次,识别核心微生物群可以提供潜在的新的生物策略来减少N2O排放,例如阻止传统策略之外的关键物种的相互作用。重要的是,它仍然需要精心设计的实验室和田间试验,以将研究结果转化到农业土壤中,并评估缓解策略的结果。 

参考文献

Xian Xiao, Manuel Delgado-Baquerizo, Haoyang Shen, Zhiyuan Ma, Jizhong Zhou, Bo Sun & Yuting Liang (2023). Microbial interactions related to N2O emissions and temperature sensitivity from rice paddy fields. mBio, https://doi.org/ 10.1128/mbio.03262-22

作者简介

200f9c17065903c408fa85853ae0a2ea.jpeg

第一作者

肖娴

副教授

主要从事土壤微生物生态与物质循环和土壤微生物修复技术等方面的研究。发表SCI论文16篇,中文核心论文5篇。主持国家自然科学基金青年科学基金项目1项,江苏省高等学校自然科学研究面上项目1项。

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通讯作者

梁玉婷

中国科学院南京土壤研究所 研究员

主要从事土壤微生物学领域研究。发表SCI 70余篇,中文核心10余篇。承担国家自然科学优秀青年基金、江苏省杰出青年科学基金等,中科院青促会优秀会员,担任《土壤学报》、Soil Ecology Letters、SBB、Geoderma等编委,中国土壤学会土壤质量标准化委员会主任、江苏省土壤学会学术工作委员会主任。

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