Nature Microbiology | 洛桑大学Philipp组发现S. alvi的肠道定植依赖于宿主代谢的有机酸...-CSDN博客

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宿主来源的有机酸使蜜蜂共生体Snodgrassella alvi能够在肠道定植

Host-derived organic acids enable gut colonization of the honey bee symbiont Snodgrassella alvi

Article，2024-01-15，Nature Microbiology， [IF 28.3]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41564-023-01572-y

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41564-023-01572-y

通讯作者：Philipp Engel

主要单位：洛桑大学基础微生物学系

- 摘要 -

不同的细菌可以通过摄取营养物质或参与微生物交叉喂养的相互作用在动物肠道中定植。宿主来源的营养物质在肠道细菌定植中的作用尚不清楚。在这里，作者研究了西方蜜蜂（Apis mellifera）和核心肠道微生物群成员Snodgrassella alvi之间进化的古老共生关系中的代谢相互作用。这种β变形菌不能代谢糖，但可以在仅摄入糖的蜜蜂的肠道中定植。利用比较代谢组学、¹³C示踪剂和纳米级二次离子质谱（NanoSIMS）方法，作者在体内发现S. alvi生长在宿主来源的有机酸上，包括柠檬酸盐、甘油酸盐和3-羟基-3-甲基戊二酸盐，这些有机酸由宿主主动分泌到肠道中。S. alvi还通过将犬尿氨酸转化为邻氨基苯甲酸来调节肠道中的色氨酸代谢。这些结果表明，S. alvi适应了蜜蜂肠道中依赖于宿主来源的营养资源的特定代谢生态位。

- 结果 -

图1 S. alvi通过消耗宿主、花粉和Gilliamella驱动的代谢物在只喂糖水的蜜蜂定植。

a. 蜜蜂定植实验概述。包括四种定植处理（无细菌、S. alvi、Gilliamella或共定植定植）和两种饮食处理（无菌糖水加花粉或仅无菌糖水），在五个蜂巢的蜜蜂中重复进行。定植后5天，杀死益生菌蜜蜂，量化肠道内的细菌负荷和代谢物。

b. 利用S. alvi特异性16S rRNA基因引物，通过qPCR测定每个蜜蜂肠道的S. alvi细胞数量（细菌基因组等效物数量）。每个值代表单个蜜蜂肠道中的细胞数量，红色条代表中位数，水平黑色线代表qPCR检测限（LOD）< 10⁴。对于每个处理，饲料中花粉的存在/不存在用±符号表示。采用双侧Wilcoxon秩和检验，以S. alvi（-花粉）为对照组（无细菌组，P = 2.37 × 10⁻⁷；无细菌（+花粉）组，P = 5.73 × 10⁻⁷)。

c. S. alvi定植定植（花粉±，n = 11/12）与MF蜂（即“无细菌”处理）（花粉±，n = 12/10）肠道代谢物含量差异显著。显著消耗和显著产生的代谢物分别用蓝色和橙色表示。采用双侧Wilcoxon秩和检验计算调整后的P值，并采用Benjamini-Hochberg (BH)校正。

d. 线性混合效应模型的结果显示了微生物定植和饮食对z-score标准化代谢物丰度的贡献（固定效应大小）。仅注释与S. alvi定植显著相关的代谢物（n = 95，采用REML拟合线性混合效应模型，蜂群为随机效应，P值采用BH校正进行多重检验调整）。较大的值（±）表明一个因子与代谢物丰度的相应变化之间有很强的相关性。零附近的值（虚线内）表明改代谢物变化不显著。花粉的效应大小由各代谢物的颜色表示，红色表示显著正相关，蓝色表示显著负相关。图的四个角代表了S. alvi和Gilliamella之间的四种代谢相互作用（从左上角开始：Gilliamella消耗S. alvi的代谢物，两种细菌共同生产的代谢物，S. alvi消耗Gilliamella的代谢物，共同消耗的代谢物)。羧酸主要集中在图的左下方，表明它们在S. alvi和Gilliamella的定植中较少。

图2 肠道代谢物丰度和同位素标记揭示了S. alvi底物的宿主来源。

a. 从羽化（第0天）到成年（第6天），MF蜜蜂肠道中选定代谢物的丰度增加。除了咖啡酸和乳酸以外，所有的代谢产物在直接从蜜蜂6天内消耗的等量花粉中提取时的含量都很低。所有的蜜蜂都来自同一个蜂巢。花粉提取物的定量根据每只蜜蜂的平均花粉消耗量进行调整。柱状图显示了每个代谢物的平均值 + 标准差（n = 8）。

b. 在向MF蜜蜂喂食[U-13C6]葡萄糖后，肠道中¹³C代谢物的富集(%)显示羧酸和非必需氨基酸变得高度标记。深色和浅色条分别表示食物中是否含有花粉。实线表示自然富集¹³C (1.108%) ，虚线表示喂养蜜蜂的糖水溶液富集¹³C。柱状图显示了两个饮食组中蜜蜂代谢物的平均值 + 标准差（n = 4）。所有的蜜蜂都来自同一个蜂巢。对于具有多个分析特征的代谢物，优先选择了含有最多碳原子的一个特征进行绘图。请参阅“Code availability”部分了解数据质量过滤步骤。

图3 S. alvi通过宿主葡萄糖代谢产生的底物来积累生物量

a. 脉冲-示踪同位素标记无菌蜜蜂实验设计。刚羽化的无菌蜜蜂喂食100% ¹³C标记的葡萄糖4天(96 h)，用一定数量的S. alvi定植，定植24 h后用¹²C葡萄糖代替¹³C葡萄糖。时间轴显示了蜜蜂被取样进行c.f.u.计数，GC-MS和NanoSIMS分析的时间。所有的蜜蜂都来自同一个蜂巢。

b. 接种后72 h内，回肠中S. alvi的定植水平表现为初始的迟缓期，随后细胞数量呈指数增长。用可检测到c.f.u.的蜜蜂的百分比表示定植成功。粉红色方块表示S. alvi的接种量(OD = 0.1)。用虚线表示单个样本的最低检出限（70 c.f.u.）。

c. 在NanoSIMS成像的回肠横截面上，S. alvi细胞的平均`at.% ¹³C`（表示¹³C原子的百分比）迅速下降，而宿主细胞和上皮细胞的富集在72小时内保持不变。每个数据点代表目标研究范围（regions of interests，ROI）的均值，细菌ROI由单个细菌细胞组成，而上皮和宿主细胞ROI代表每张图像中上皮或宿主细胞组织周围的总面积，ROI原始数据处理计算参考附表3。图片的虚线表示从¹²C对照蜜蜂的NanoSIMS图像计算的自然`at.% ¹³C`丰度。

d. 在¹²C追踪阶段，肠道中代谢物的¹³C富集度稳步下降。点表示在给定时间点采样的蜜蜂中某一代谢物的平均¹³C富集度。平均值和颜色按代谢物类别显示：羧酸（蓝色）、非必需氨基酸（NEAA，绿色）、必需氨基酸（EAA，黄色）。阴影区域包含每种代谢物类别的最大和最小值，n＝3。测量的代谢物列于附表3中。1.1%处的虚线表示自然¹³C丰度。

e. 蜜蜂肠道示意图，黑色条表示回肠区域的横截面。接种48 h和72 h后，两只不同¹³C标记的蜜蜂的TEM图像和相应的NanoSIMS图像。白色箭头表示S. alvi。比例尺，5 μm。

图4 宿主合成的化合物可促进S. alvi在体外生长。

a. 描述生长和上清液分析的示意图。Bee9培养基源自M9基础培养基。

b. 在培养基中添加（+）或未添加（−）柠檬酸盐的单一碳源的最大生长速率表明，柠檬酸盐+3Hmg（3-hydroxy-3-methylglutarate，3-羟基-3-甲基戊二酸）的生长速度比其他所有条件都快，包括将所有底物混合在一起。平均值是通过独立的生物重复计算得出的（柠檬酸盐（+），n=3；柠檬酸盐（-），n=4）。使用BH校正的双侧Wilcoxon秩和检验计算调整后的显著性值，以柠檬酸盐（+）组为对照（虚线）。

c. 相对于仅在柠檬酸盐上生长的情况，上清液中羧酸化合物的丰度随生长底物的变化而变化。虽然包括α-酮戊二酸和苹果酸在内的某些羧酸在大多数条件下都会产生，但乙酸仅在培养基中添加丙酮酸或3Hmg时才会产生（倍数变化为改组的平均值，n=3）。

d. 向培养基中添加犬尿氨酸会导致邻苯二酚氨酸、犬尿酸和L-色氨酸的产生。通过配对的双向t检验分析新鲜培养基与废培养基之间的变化差异是否显著（n=3）（邻氨基苯甲酸，* P = 0.015；犬尿胺酸，** P = 0.004；L-色氨酸, * P = 0.039)。

GC-MS示意图用BioRender.com创建。

图5 不同Snodgrassella菌株的肠道定植和宿主代谢物的消耗中是保守的。

a. 不同Snodgrassella菌株在单菌蜜蜂糖水喂养中的定植水平。粉红色横条表示每个组别中的肠道菌株cfu中位数。LOD（< 70个菌落/肠道）用水平虚线表示。顶部条形图表示A. mellifera（西方蜜蜂）与Bombus sp.（熊蜂）的原生Snodgrassella菌株。每个菌株的定植成功率（%）显示为具有可检测的cfu计数的肠道。该实验在两个蜂巢中重复进行。

b. 不同菌株中蜜蜂肠道代谢物变化的火山图。每个代谢物绘制五次（每个Snodgrassella菌株绘制一次），与MF蜜蜂有显著差异的代谢物按照菌株编码颜色。只有3Hmg和邻苯二酚氨酸在所有五个菌株中被显著消耗或富集，而四个菌株消耗次黄嘌呤、苹果酸和尿素，三个菌株消耗GABA、延胡索酸、甘油酸、异柠檬酸和琥珀酸。调整后的显著值通过使用双向Wilcoxon秩和检验与BH校正计算得出（MF，n=12；wkB2，n=12；ESL0304，n=12；ESL0323，n=13；ESL0251，n=17；ESL0897，n=12）。

图6 S. alvi在回肠中代谢宿主来源化合物的模型图。

宿主代谢物（蓝色）通过肠上皮细胞或回肠上游的马氏管进入回肠。S. alvi主要使用TCA循环来产生能量，然后通过糖异生反应合成生物质。3Hmg为TCA循环提供乙酸。然而，合成前两步的反应（虚线粉红色箭头）在基因组中尚未注释。宿主合成的尿素是氮的来源，犬尿氨酸被转化为邻苯二酚氨酸作为色氨酸代谢的一部分。蓝色箭头表示由宿主代谢提供的底物。

参考文献

Quinn, A., El Chazli, Y., Escrig, S. et al. Host-derived organic acids enable gut colonization of the honey bee symbiont Snodgrassella alvi. Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01572-y

- 通讯作者简介 -

洛桑大学

Philipp Engel

副教授

Philipp Engel的总体研究目标是了解微生物群落的进化和功能。社会性蜜蜂肠道微生物群的简单组成、高度特异性和实验可操作性使其成为解决这类问题的理想系统。Philipp结合宏基因组测序和其他“组学”方法和相关实验，从菌株水平上研究微生物群落及其相关的多样性。

目前的研究重点包括：

肠道细菌对蜜蜂健康的影响。
蜜蜂肠道细菌诱导的宿主表型特征。
肠道共生细菌因子的特征。
与肠道微生物群细菌多样性相关的基因组变化的评估。

实验室主页：https://engelbeelab.com/

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