【实验技术笔记】Western Blotting 实验操作要点及数据分析

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1. 样品制备

• ① 裂解：
  ◆ 细胞：弃培养上清，无菌 PBS 清洗 1-2 遍（去除细胞和培养皿表面残留的培养基，因为培养基中血清含有丰富蛋白质），加入细胞裂解液（80-100ul/60mm dish） 和蛋白酶抑制剂，置摇床上摇动裂解，注意随时观察。最好冰上裂解（摇床上放冰盒，培养皿放在冰盒中）。
  ◆ 组织：将组织块切割成合适大小，无菌 PBS 漂洗 1-2 遍，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，高速匀浆机匀浆（低温匀浆：装有组织块的 2ml 平底 EP 管外面套一个装满碎冰的小烧杯）或高通量组织破碎仪破碎（提前预冷裂解液，把破碎过程分成几段，缩短每一小段的破碎时间，破碎的间隙把装有组织的 EP 管埋在碎冰里降温几分钟，再接着下一小段的破碎过程）。最好低温裂解。
• ② 去除碎片（充分裂解细胞或组织后，会有一些细胞碎片没办法完全溶解在裂解液中，需要去除）：4℃下 12000rpm 离心 10-20min，取上清。（离心后细胞碎片沉在管底，上清中是抽提出的蛋白）
• ③ 蛋白定量： BCA 法测定蛋白浓度后分装。
• ④ 蛋白变性：加 loading buffer，沸水浴煮 5min。（沸水浴容易把 EP 管盖冲开，为了防止污染，也可以用金属浴或 PCR 仪来使蛋白变性。）
• ⑤ 保存：分装变性后的蛋白质样品-20℃保存，长期保存-80℃。也可以一裂解完就冻存在-80℃，样品凑齐后再拿出来一起做去碎片、定量、变性等后续步骤。
• 推荐试剂：
  △ 碧云天，Western 及 IP 细胞裂解液（P0013） 裂解
  △ Pierce™ BCA Protein Assay Kit（23227） 蛋白浓度测定，推荐用 96 孔板+酶标仪来做，省试剂（一孔 200ul BCA 工作液），省事省时间（酶标仪一扫，把数据贴到 excel 里，就能算出每个蛋白的浓度，还可以第一次计算时保存好模板，下次直接往模板里填数据就能得到各个浓度和每管分装体积）。
  BCA 法标曲制作：（官方说明书操作较复杂，简化一下）试剂盒自带的 BSA 标准品浓度是 2ug/ul，设标曲梯度：准备 7 个孔，每孔依次加入 20, 19,18,17,16,15,14 ul 去离子水，0,1,2,3,4,5,6ul BSA 标准品，因此得到的标曲的蛋白点就是 0,2,4,6,8,10,12ug （可以覆盖普通裂解液蛋白抽提范围，超高浓度的蛋白不适用）。
  
  △ Sigma，Sample Buffer, Laemmli 2× Concentrate（S3401） 蛋白变性，蛋白沉底好，不容易飘，上样顺畅。缺点：2×的，所以只适用于蛋白浓度高的样品。只是普通蛋白抽提也可以用碧云天（国货精品）的 loading buffer。

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2. SDS-PAGE 胶制作及电泳分离

2.1 灌胶

• ① 洗玻璃板：玻璃板有不同规格的，能制备不同厚度的 PAGE 胶，要注意选择合适的制胶玻璃板，在制胶前，要使用洗涤剂充分洗净玻璃板和制胶梳子，去离子水冲洗数遍，把玻璃片斜靠在网篮里自然晾干，注意不要有水渍。
• ② 装配制胶架：玻璃板应该是配对的（一片是带玻璃直角的厚板，一片是平滑的薄板），把配对的玻璃板对好，保持两片玻璃板的底边在同一水平面，用制胶支架固定住，再安装到固定架上。注意制胶支架松紧度（紧）、制胶固定架上的夹子上的弹簧的弹性（紧）以及固定架上胶条是否干净，是否具有很好的回弹力，灌胶时要时刻注意是否漏胶，如果稍有些漏，可以在固定架上卡一个 1ml 枪头，如上图，可以人为把固定架上的夹子弄紧一点。如果漏得厉害，就没辙了，只能重新把这一套组装起来。所以最好是