探讨肠道微生物群与癌症之间的因果关系

今天给同学们分享一篇肠道微生物群+孟德尔随机化的生信文章“Identifying and ranking causal microbial biomarkers for colorectal cancer at different cancer subsites and stages: a Mendelian randomization study”，这篇文章于2023年7月19日发表在Front Oncol期刊上，影响因子为5.738。

肠道微生物组直接参与了结直肠癌的发生，但关于肠道微生物组对结直肠癌（CRC）风险影响的流行病学证据大多来自观察性研究，目前还不清楚已确定的微生物改变是导致 CRC 发生的原因还是结果。

图1 孟德尔随机化分析的研究设计

1. 单变量 MR

排除不符合IV标准的SNP后，3310个SNP与412个微生物性状密切相关。为了评估IV的强度，计算了每个SNP的F值，IV的F统计量介于408和797之间，均大于10，表明不存在弱工具变量偏差。通过 Phenoscanner 查询，发现 rs2450114 与 BCR 和 BR 密切相关（P < 1×10 -5 ），因此删除该 SNP，继续进行 MR 分析。

利用IVW（M）、Wald比率和MR Egger方法，我们发现40个微生物性状与CRC、56个微生物性状与CC、43个微生物性状与CR、45个微生物性状与BCR、40个微生物性状与BC、43个微生物性状与BR之间存在潜在的因果关系（P < 0.05），其中12个微生物性状与CRC、20个微生物性状与CC、12个微生物性状与CR、10个微生物性状与BCR、9个微生物性状与BC、14个微生物性状与BR之间存在明显的因果关系（IVW（M）MR，P fdr < 0.2）。结肠和直肠的肠道微生物生物标志物也存在差异。详见图 2、图 3。

图2 微生物性状对恶性肿瘤因果效应的 MR 森林图

图3 微生物性状对良性肿瘤因果效应的 MR 森林图

关于微生物性状与恶性肿瘤之间的因果关系，IVVW（M）分析表明，链球菌是 CRC（OR = 0.804，95%CI = 0.691 ~ 0.935，P = 0.005）和 CC（OR = 0.844，95%CI = 0.770 ~ 0.925，P = 0.0003）的显著保护因子。此外，经 FDR 校正后发现，嗜热链球菌（OR = 0.802，95%CI = 0.688 ~ 0.936，P = 0.005）和嗜酸链球菌（OR = 0.843，95%CI = 0.734 ~ 0.968，P = 0.015）与 CRC 存在负因果关系。Eubacterium ventriosum（OR = 0.781，95%CI = 0.684 ~ 0.892，P = 0.0003）是 CC 的保护因子；Erysipelotrichaceae（OR = 0.800，95%CI = 0.685 ~ 0.935，P = 0.005）、Coprococcus sp_ART55_1 （OR = 0.749，95%CI = 0.586 ~ 0.956，P = 0.021）和 Eubacterium siraeum （OR = 0.716，95%CI = 0.527 ~ 0.973，P = 0.033）对 CR 有潜在的保护作用。

结果表明，肠道微生物性状与良性肿瘤之间存在因果关系。卵形乳杆菌与 BCR（OR = 1.12，95%CI = 1.01 ~ 1.23，P = 0.03）、BC（OR = 1.12，95%CI = 1.01 ~ 1.25，P = 0.04）和 BR（OR = 1.17，95%CI = 1.02 ~ 1.35，P = 0.03）呈提示性因果关系。未分类的 Sutterellaceae（OR = 0.785，95%CI = 0.636 ~ 0.969，P = 0.024）与 BR 有因果关系。MR Egger 分析表明，青春期双歧杆菌对 BCR（OR = 1.666，95%CI：1.100 ~ 2.524，P = 0.043）和 BC（OR = 1.584，95%CI = 1.088 ~ 2.305，P = 0.042）是一种潜在的危险微生物。

Cochran's Q 统计显示，只有 GLYCOCAT PWY：糖原降解 I：细菌.CC 存在异质性（Q = 23.412，Q_pval = 0.005）。剔除 MR-PROSSO 分析中显示水平多向性的 SNPs 后，IVs 中没有异质性（Q_pval > 0.05）。虽然有一些潜在的生物标志物（如青春期双歧杆菌和 Sutterellaceae 等）在 IVW(M) 分析结果中没有显示出相关性，但 MR-Egger 分析显示这些生物标志物的遗传变异之间存在一定程度的褶积性，而且 MR-Egger 和 MR-PROSSO 的结果显示与结果存在潜在的因果关系。此外，MR-Egger 分析表明，其他微生物性状不存在水平多向性（P > 0.05）。MR-PRESSO 结果显示，Sutterellaceae 和 CRC（P = 0.006，多重 SNPs：rs2004833、rs28517505 和 rs59033852）、GLYCOCAT PWY：糖原降解 I：细菌和 CC（P = 0.009，多态性 SNP：rs115001375 和 rs59657730）、Bilophila wadsworthia 和 BCR（P = 0.035，多态性 SNP：rs10276776）、Bilophila wadsworthia 和 BR（P = 0.007，多态性 SNP：rs10276776）、Eubacterium hallii 和 BR（P = 0.017，多态性 SNP：rs1330325）。剔除异常值后，结果发生了很大变化，Sutterellaceae 与 CRC（OR = 0.85，95% CI = 0.66 ~ 1.10，P = 0.23）、Bilophila wadsworthia 与 CRC（OR = 0.91，95% CI = 0.79 ~ 1.06，P = 0.243）、Eubacterium hallii 与 BR（OR = 1.056，95% CI = 0.854 ~ 1.306，P = 0.616）之间没有因果效应。GLYCOCAT PWY：糖原降解 I：细菌，Bilophila wadsworthia 与 CC（OR = 0.929，95% CI = 0.551 ~ 0.966，P = 0.028，Q_pval = 0.229）和 BR（OR = 0.712，95% CI = 0.515 ~ 0.984，P = 0.040, Q_pval = 0.324）。其他微生物性状的 MR-PROSSO 结果显示没有水平多效性（P > 0.05），或者 MR-PROSSO 无法识别多效性 SNPs。此外，MR Steiger 分析表明，从暴露到结果之间存在正向因果关系（所有 P < 7×10 -5 ），而且同位分析发现暴露和结果的变化不是由相同的潜在遗传变异引起的（基于 PP.H4.abf < 0.8），这表明因果回归返回的因果效应估计值是无偏的。

我们将这些微生物性状与六种非结肠直肠癌疾病进行了双样本单变量 MR 分析，以探讨这些细菌是否是结肠直肠癌的特异性生物标志物。结果发现，未分类的苏特雷科细菌也是一种对非酒精性脂肪肝有显著保护作用的微生物（OR = 0.811，95% CI = 0.705 ~ 0.934，P = 0.004），而赤藓红菌科细菌能显著降低肠易激综合征的风险（OR = 0.897，95% CI = 0.844 ~ 0.954，P = 0.0006）。

2.&nbsp;潜在生物标志物排名

我们使用 MR-BMA 对名义上与 MR 结果显著相关的微生物生物标记物进行排序，根据其 MIP > 0.1。对于恶性肿瘤：CRC 的前三个生物标志物是假黄杆菌（MIP = 0.91，MACE = 0.26）、嗜热链球菌（MIP = 0.56，MACE = -0.11）和猫科动物球菌（MIP = 0.43，MACE = -0.11）。与 CC 相关的生物标志物有：伽马蛋白菌（MIP = 0.20，MACE = -0.03）、Eubacterium ventriosum（MIP = 0.17，MACE = -0.03）、Holdemania unclassified（MIP = 0.15，MACE = -0.02）和 Sutterella wadsworthensis（MIP = 0.14，MACE = -0.02）。与 CR 相关的生物标志物是 Coprococcus sp_ART55_1（MIP = 0.45，MACE = -0.09）、Desulfovibrio（MIP = 0.36，MACE = -0.11）和 Erysipelotrichaceae（MIP = 0.17，MACE = -0.04）。

就良性肿瘤而言，BCR 的危险因素是类杆菌属（MIP = 0.43，MACE = 0.063）、青春期双歧杆菌属（MIP = 0.34，MACE = -0.05）、卵形乳杆菌属（MIP = 0.23，MACE = 0.03）和未分类的 Subdoligranulum（MIP = 0.14，MACE = -0.02）。BC 的风险因素只有卵形乳杆菌（MIP = 0.81，MACE = 0.12）。BR 的风险因素有三个：酸性球菌科（MIP = 0.82，MACE = -0.17）、直肠杆菌科（MIP = 0.35，MACE = -0.09）和未分类的 Sutterellaceae（MIP = 0.15，MACE = -0.02）。所有其他风险因素的 MIP 均小于 0.1。这些生物标志物的 MACE 方向也与我们的 MR 结果一致。在对 CC 和 CR 的初步分析中，影响点的检测分别突出了 rs12736307 和 rs76321722，它们对分析的影响更大。其余结果中的遗传变异与较大的 q 统计量或库克距离不一致。

3.&nbsp;微生物风险因素识别

在本节中，我们选择了 MIP 值排名前 10 的微生物作为结果的 "真正 "因果风险因素。其中，MIP 大于 0.2 并与其他分析结果交叉验证的结果如下：在恶性肿瘤方面，嗜热链球菌（MIP = 0.36，MACE = -0.037）和红细胞菌（MIP = 0.138，MACE = -0.018）是 CRC 的风险因素。CC中风险最高的微生物性状是通风杆菌（MIP = 0.219，MACE = -0.029）和链球菌（MIP = 0.118，MACE = -0.017）。CR 的风险因素包括 Erysipelotrichaceae（MIP = 0.284，MACE = -0.064）、Eubacterium siraeum（MIP = 0.106，MACE = -0.021）和 Coprococcus sp_ART55_1（MIP = 0.103，MACE = -0.011）。对于良性肿瘤，BCR 的风险因素包括卵形乳杆菌（MIP = 0.178，MACE = -0.017）和青春期双歧杆菌（MIP = 0.043，MACE = -0.003）。而与 BC（MIP = 0.032，MACE = 0.002）和 BR（MIP = 0.136，MACE = 0.022）相关的风险因素有卵菌。微生物风险因素鉴定的结果，检测出 BR 的影响点突出 rs9884588，对分析影响较大。其余结果中的遗传变异都没有较大的 q 统计量或一致的 Cd，也没有需要剔除的异常值或影响点。

4.&nbsp;NetMoss 分析

利用 NetMoss 方法，我们发现卵形乳杆菌和未分类的 Sutterellaceae 是区分腺瘤和健康人群的生物标志物（图 4A）。Erysipelotrichaceae, Sutterellaceae, Streptococcus, Bacteroides ovatus 和 Eubacterium siraeum 是区分 CRC 和健康人群的生物标志物（图 4D）。上述方法中的这些生物标志物表明它们与 CRC 的发生有因果关系。同时，我们也发现了一些与 MR 结果不一致的微生物（图 4A-I）。

图4 NetMoss 结果图

5.&nbsp;中介分析

由于膳食习惯对预防和治疗 CRC 至关重要，而肠道微生物群可能是不同癌症亚位点和分期的膳食习惯对 CRC 影响的中介。通过 "系数乘积 "法，我们共发现了 20 条膳食习惯调节肠道细菌进而影响 CRC 发生和发展的因果通路（图 5 和表 3），其中 10 条因果通路的中介方向与膳食习惯-结果方向一致。包括目前的饮酒状况对 CC 的影响部分由 Eubacterium ventriosum（间接效应（β）= 4.748，P=0.002，中介比例为 43.044%）中介；膳食纤维对 CC 的影响部分由 Eubacterium ventriosum（间接效应（β）= 4.748，P=0.002，中介比例为 43.04443.044%）；谷物类型：饼干谷物（如维他谷物）可能会通过降低嗜热链球菌的丰度来降低患 CRC 的风险（β = -0.417，P = 0.941，介导比例：13.973%）；摄入过多的铁蛋白会导致嗜热链球菌丰度下降，进而导致患 CRC 的风险增加（β = 0.09，P = 0.02，介导比例：34.22%）；卵形乳杆菌介导了矿物质和其他膳食补充剂的影响：钙（β = 0.327，P = 0.053，介导比例：11.854%）和面包摄入量（β = 0.068，P = 0.041，介导比例：12.639%）。最后，通过青少年双歧杆菌估计了从不/很少喝牛奶对 BCR 的间接影响，发现青少年双歧杆菌的中介效应为 23.453，中介比例为 435.399%。

图5 饮食-肠道细菌-大肠癌路径图的介导分析

总结

总之，本研究进行了一项全面的探索性孟德尔随机化研究，发现了 6 种对恶性肿瘤有保护作用的细菌、2 种风险细菌和 1 种对良性肿瘤有保护作用的细菌。研究结果支持肠道微生物群是 CRC 病因的假说，而且对不同癌症亚部位和分期的 CRC 的影响不同，表明微生物对 CRC 的预防、治疗和改善具有特异性。其中，嗜热链球菌对 CRC 的保护作用已被细胞和动物实验所验证。同时，中介分析的结果为改变饮食习惯来调节肠道细菌，进而影响不同癌症亚位点和不同阶段的 CRC 提供了理论支持和实证证据，表明控制肠道菌群可能是特定饮食人群预防结直肠癌的一种有前景的策略。此外，这些发现还为进一步的机理研究（如动物模型或基于生物标志物的人体试验）提供了思路和方向，有助于指导基于微生物群的潜在癌症预防策略的开发和临床转化。