今天给同学们分享一篇生信文章“Bulk and single-cell transcriptome profiling reveal extracellular matrix mechanical regulation of lipid metabolism reprograming through YAP/TEAD4/ACADL axis in hepatocellular carcinoma”，这篇文章发表在Int J Biol Sci期刊上，影响因子为9.2。
结果解读：
大规模转录组分析揭示了肝细胞癌中明显的代谢失调
为了研究肝细胞癌（HCC）代谢重编程的机制，作者从京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库中选择了与86个代谢途径相关的2886个人类基因。为了揭示HCC的代谢异质性，作者根据基因集变异分析（GSVA）估计了癌症基因组图谱（TCGA）队列中每个样本中74个代谢途径的富集分数，其中有12个途径由于样本量相对较低而被过滤掉。根据层次聚类结果，作者发现三个聚类解是TCGA数据集的最佳解，并将其应用于聚类模型中。根据74个代谢途径的富集分数，将所有374个HCC肿瘤分为三个异质亚型，即聚类1至聚类3（图1A-E）。聚类1（34.所有肿瘤中的5％（n = 129）的特点是糖代谢途径的相对上调，包括N-糖基生物合成、O-糖基生物合成和软骨硫酸盐生物合成，这些途径都与细胞外基质（ECM）的产生有关，但三种主要营养物质（碳水化合物、脂质和氨基酸）的代谢途径被下调。34.2％的所有肿瘤（n = 128）的Cluster 3的特点是脂质、氨基酸和碳水化合物代谢途径的显著上调，包括脂肪酸降解、精氨酸生物合成、组氨酸代谢和丙酮酸代谢。31.3％的所有肿瘤（n = 117）的Cluster 2的特点是各个主要类别的联合失调。使用GSE14520和ICGC数据库的外部独立队列观察到类似的模式。肿瘤纯度被认为是异质性研究中的一个常见影响因素，因为肿瘤纯度的变化可能导致异质性估计的偏斜。使用“Estimate” R软件包进行了肿瘤纯度分析。在三个亚型中，肿瘤纯度没有统计学上显著差异。主成分分析（PCA）显示存在三个明显的转录组亚型（图1D）。此外，这三个亚型表现出不同的临床特征。值得注意的是，亚型3的大多数患者为男性（p < 0.001），年龄较大的患者比例较高（p < 0.05）。亚型1的患者具有显著较高的肿瘤分级百分比（p < 0.001）和更晚期的临床分期（p < 0.05）。此外，亚型1的整体生存率（OS）（p < 0.01）和无病生存率（DFS）（p < 0.01）明显较差于亚型3（图1F，G）。此外，作者接下来进行了GSVA分析，以了解每个亚型的Hallmark基因集的生物过程和通路的动态。GSVA/Hallmark通路分析显示，在亚型1中，wnt β-catenin信号通路、TGF-β信号通路和PI3K/Akt mTOR信号通路显著上调，暗示多种与癌症相关的通路被激活。总的来说，作者的研究结果表明，肝细胞癌（HCC）的代谢异质性可分为三种代谢表型。通过不同的分析方法，作者发现细胞外基质受体相关通路在第一类亚型中显著富集，而脂肪酸代谢通路则被下调。总的来说，脂肪酸代谢的下调与肿瘤的侵袭性相关。
代谢途径基于的聚类显示出独特的基因组和转录组特征
为了确定聚类1的肿瘤是否具有可能抑制其代谢表型的独特转录组程序，作者构建了火山图，比较了聚类1和聚类3样本中的基因表达情况（图2A）。为了探索聚类1和聚类3之间差异表达基因与特定功能特征的关系，作者对每个差异表达基因组进行了KEGG和REACTOME分析。发现有关有丝分裂细胞周期检查点、细胞周期阶段和细胞外基质组织的通路在聚类1中相对富集，而与物质代谢过程（如氨基酸和衍生物代谢、脂肪酸代谢和细胞色素P450代谢）相关的基因集在聚类3中相对富集（图2B）。在circos图中使用KEGG分析得到了类似的结果。与肿瘤发生和发展相关的类别，如“细胞周期”和“细胞外基质受体相互作用”，在聚类1中富集（图2C）。脂质相关的代谢途径，包括视黄醇代谢、类固醇激素合成、胆汁分泌和脂肪酸降解，在聚类3中富集（图2D）。基因集富集分析（GSEA）进一步表明，与聚类1相比，聚类3中的脂肪酸和胆汁酸相关的代谢途径显著上调，而“黏附斑点”、“细胞黏附分子”、“细胞外基质受体相互作用”和“Hippo信号通路”等途径在聚类1中显著上调（图2E，F）。此外，为了研究两个亚型之间的体细胞变异差异，作者使用Maftools访问HCC驱动基因，并进一步分析具有最高突变频率的前20个基因（图2G，H）。结果显示，在聚类1和聚类3组中，CTNNB1和TP53的突变频率存在显著差异（卡方检验，p值均小于0.001）。根据以上结果，作者发现ECM相关途径的上调通常伴随着脂质代谢途径的下调。综合而言，脂质代谢的生物过程可能与细胞外基质的组成有关。
癌相关成纤维细胞（CAF）和脂肪酸降解途径之间的相关性
通路分析表明，这些代谢通路富集了氨基酸和脂质代谢，尤其是脂肪酸降解，也被称为“脂肪酸氧化（FAO）”（hsa00071）（图3A）。作者基于代谢的分类反映了脂肪酸降解通路中所有基因的表达水平，这些基因在聚类3中富集，并且大多数基因的mRNA水平与其他亚组相比显著较高（图3B）。生存分析显示，FAO通路富集得分较高的患者与富集得分较低的患者相比，DFS和OS更好（p < 0.01；图3C、D），表明FAO通路的激活可能抑制HCC的发生和发展。FAO通路的下调可能导致脂质积累，通常会产生免疫抑制效应，并促进肿瘤生长和转移。然后，作者使用微环境细胞种群计数器（MCP计数器）（图3E，F）研究了微环境中不同细胞亚群的转录模式，并发现了亚型1和亚型3之间的显著差异。与亚型3中的患者相比，亚型1中T细胞系谱、细胞毒性淋巴细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓系细胞和癌相关成纤维细胞（CAFs）的丰度显著较高，尤其是CAFs。事实上，亚型1的患者表达了高水平的CAFs标记物COL1A1、POSTN、LUM、ACTA2、MCAM、PDGFRA以及胶原合成酶基因（图3G）。此外，CAFs浸润评分与FAO富集评分呈负相关（Pearson's R = -0.32，p<0.001，图3H）。同时，FAO与成纤维细胞迁移、胶原激活信号通路、胶原形成、胶原受体活性和胶原生物合成过程呈显著负相关（图3H）。
基于scRNA-seq数据的肿瘤微环境中恶性细胞和其他细胞的代谢途径亚型
单细胞分辨率可以帮助作者更好地了解肿瘤亚克隆多样性和肿瘤微环境的精确性质。因此，作者试图确定在单细胞水平上是否可以区分三个聚类之间的代谢差异。作者首先分析了GEO: GSE151530数据库，其中包括46个原发性肝肿瘤样本，并研究了肿瘤微环境中细胞的代谢异质性。
细胞根据数据集中的标签被分为七种主要细胞类型，包括T细胞（n = 9286）、恶性细胞（n = 4784）、未分类细胞（n = 3007）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）（n = 2184）、B细胞（n = 1718）、肿瘤相关内皮细胞（TECs）（n = 1580）和CAFs（n = 919） (图4A)）。基于受体-配体相互作用的CellPhoneDB分析揭示了HCC中的细胞通讯。作者的分析显示，恶性细胞与TAMs以及CAFs之间的受体-配体对之间的相互作用明显增加，表明这两个细胞群之间存在密切的细胞间通讯。作者使用scMetabolism R软件包在统一流形逼近和投影（UMAP）表示中可视化单个细胞的代谢多样性。结果显示，脂肪酸降解途径主要富集在恶性细胞中，而细胞外基质蛋白聚糖途径富集在CAFs中（图 (图4B, 4B, C）。此外，作者使用GSVA在批量RNA-seq水平评估了每个患者的通路富集得分。有趣的是，所有患者根据相同的聚类方法被稳定地分配到三个代谢亚型中（图4D、E）。与TCGA批量RNA测序的结果类似，脂肪酸降解得分在亚型3中显著上调，而O-糖代谢在亚型1中上调。值得注意的是，亚群是高度个体特异性的，每个细胞类型的比例在不同亚型中差异很大（图4D）。为了比较不同亚型的恶性细胞中脂肪酸降解得分，作者提取了恶性细胞进行进一步分析。一致的结果显示，与亚型1相比，亚型3中的脂肪酸降解得分显著上调。在所有细胞类型和亚型之间进行的ReactomeGSA分析显示了与脂肪酸代谢和细胞外基质相关的途径的类似结果。胶原相关途径，如“胶原形成”和“胶原链三聚化”，在CAF和亚型1中显著富集。脂质代谢途径在恶性细胞和亚型3中显著富集（图4F、G）。根据皮尔逊相关性，上述通路的表达模式被聚类成热图。可以观察到上述通路的水平在肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和恶性细胞之间呈现强烈的负相关（皮尔逊相关系数R = -0.57，图4H），这与批量RNA测序的结果一致，即脂肪酸降解可能与CAFs的功能相关。
作为脂肪代谢的关键酶，ACADL在肝细胞癌中被下调
为了探索可能在脂肪酸代谢中发挥作用的重要分子，作者总结了在聚类3中高表达的前十个途径的关键酶。TCGA HCC数据集的单变量Cox回归分析显示，只有与FAO相关的基因（ACADL）仍然显著（p <0.05）（图5A）。ACADL是线粒体中催化FAO的第一步的关键酶，不仅在HCC组织（n = 369）中发现减少，与正常肝脏（n = 160）相比（图5B）。有趣的是，相关热图显示ACADL与多种CAF和胶原相关基因呈负相关（图5C）。此外，ACADL在各种肿瘤中显著减少（图5D）。值得注意的是，ACADL表达低的HCC患者的总体生存和无病生存较ACADL表达高的患者差（图5E，F）。使用TCGA数据库中的UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）进行的肿瘤分期图分析进一步显示，ACADL表达在较高的HCC临床分期中逐渐减少。根据肝硬化的存在，HCC患者被分为2组，肝脏背景较硬的患者ACADL表达较低（p < 0.01；图 图5G）。值得注意的是，在外部验证队列中观察到了类似的结果（图5H-J）。因此，作者假设刚度可能通过调节ACADL表达来影响脂质代谢重编程。
矩阵刚度通过YAP-TEAD4-ACADL调控重新编程脂质代谢
细胞附着的基质刚度对细胞形态和基因表达有深远影响。为了测试作者的假设，即刚度可能影响脂质代谢，作者将HepG2、Huh7和SK-Hep1 HCC细胞分别种植在2 kPa和16 kPa的微刚度表面上。HCC细胞在16 kPa的硬质支撑上呈现出侵袭性表型，显示出多边形细胞的突出外观，具有典型的HCC细胞形态，而在2 kPa的硬质支撑下，细胞呈球形，看起来像小点（图6A）。
软底物增加了ACADL在体内的mRNA和蛋白质水平
作者研究的动物实验工作流程如图7A所示的示意图。β-氨基丙腈（BAPN）是一种被广泛认可的LOX活性抑制剂。先前的研究已经证明，BAPN可以降低胰岛素瘤小鼠的组织硬度。结果显示，BAPN组的肿瘤体积显著小于对照组（图7B、C，p < 0.05）。此外，对照组的肿瘤重量明显大于BAPN组（图7D，p < 0.01）。羟脯氨酸分析显示，与PBS对照组相比，BAPN组的胶原含量显著降低（图7E，p < 0.001）。ACADL在BAPN组的肿瘤组织中显示出更高的mRNA和蛋白水平，与PBS对照组相比。在BAPN组的肿瘤中，西瑞红染色显示胶原沉积在肿瘤基质组织的同一区域减少。此外，ACADL表达显著增加，而被认为是CAF标记基因的YAP和α-SMA的表达在BAPN组中明显增加（图7F）。
增加的胶原蛋白含量和ACADL下调协同预测肝细胞癌患者的不良预后
作者探讨了肿瘤组织中胶原含量和ACADL表达对预后的协同预测价值。在一个由78名HCC患者组成的独立队列中，通过组织微阵列中的免疫荧光测量ACADL的表达和肿瘤内胶原含量。作为组织硬度的替代标记，使用Image J软件自动量化I型胶原的平均荧光强度以测量胶原含量。I型胶原染色在肿瘤的基质室中特异性发现，而ACADL优先分布在细胞质中。HCC中胶原含量与ACADL表达水平呈显著负相关（图8A、B，p=0.013）。与顺应性肿瘤患者相比，肿瘤较硬的患者OS较差（p<0.01；图8C）。同时，ACADL低表达的患者比ACADL高表达的患者有更不利的结果（p<0.05；图8D）更重要的是，HCC患者的预后根据ACADL表达水平和胶原含量进行分层。与胶原低/ACADL高肿瘤患者相比，胶原高/ACADL低肿瘤患者的生存结果明显较差（p＜0.001，图8E）。同样，在TCGA-LIHC队列中，胶原高/ACADL低的肿瘤与低生存率相关（p=0.0396，图8F）。这表明增加基质硬度和ACADL下调对HCC进展的协同作用。与HBV感染的重要性相似，胶原高/ACADL低肿瘤与不良预后之间的相关性是显著的，并且与其他临床病理参数无关。
总结
在这项研究中，作者证明HCC亚群根据其代谢特征具有不同的转录组特征，这表明针对代谢脆弱性的不同治疗策略可能对HCC患者亚群具有临床益处。此外，本研究还提供了一种将基质硬度ACADL轴与脂质代谢重编程和HCC进展联系起来的新机制，表明ACADL是HCC治疗的潜在治疗靶点。
2010
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