株高|ZmTE1 通过调控玉米的节间分生组织形成和节间细胞伸长来促进株高

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https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34687251/

摘要

玉米的高度由节点数量和节间长度决定。节点数量受节间分生组织形成的驱动，而节间长度则由节间细胞的伸长决定。然而，调控节点建立和节间生长的机制尚不清楚。我们筛选了EMS诱导的玉米突变体，并鉴定出一个与**终端耳基因1（ZmTE1）**的单一碱基变异相关的矮化突变体zm66。详细的表型分析表明，zm66（zmte1-2）具有较短的节间和增加的节点数，这分别是由细胞伸长减少和节间分生组织形成紊乱引起的。转录组分析显示，zmte1-2中的生长素信号基因发生了失调，细胞伸长和细胞周期相关基因也受到影响。这表明ZmTE1调控生长素信号、细胞分裂和细胞伸长。我们发现ZmWEE1激酶能够磷酸化ZmTE1，从而将其限制在细胞核内，并可能抑制细胞分裂。相反，ZmPP2Ac-2磷酸酶促进ZmTE1的去磷酸化及其在细胞质中的定位，同时促进细胞分裂。综合来看，ZmTE1是植物高度的重要调节因子，负责维持节间分生组织的有序形成和快速的细胞伸长。ZmWEE1和ZmPP2Ac-2可能通过平衡ZmTE1的活性，控制细胞分裂和伸长，从而维持玉米的正常生长

引言

植物高度的变化会影响作物产量，进而影响粮食安全。矮化或半矮化对作物是有利的，因为它可以增强抗倒伏能力、增加种植密度，并提高收获指数，从而有利于生产。营养生长阶段的顶端分生组织（SAM）支持植物的生长和发育。顶端分生组织包含一个未分化的细胞库，能够生成地上结构的原基，包括叶片。在营养生长期间，从叶原基发起的叶片遵循保守的二列叶序。这意味着新叶在分生组织的另一侧发起，与前一片叶相对。玉米的茎由一个植物单元组成，包括叶片、叶节点、节间和腋芽分生组织单元。茎的生长主要是由于节点数量的增加和节间区域的伸长。节点细胞和节间细胞都来自同一个细胞库，即顶端分生组织。

在过去的几年中，已经分离出几个节间伸长有缺陷的突变体。水稻D50是一种可能的肌醇多磷酸5-磷酸酶（5PTase），据报道，它通过调节细胞分裂方向、细胞壁果胶的沉积和肌动蛋白的组织来促进节间分生组织（在成熟组织区域之间发育的分生组织）的形成。Os-GRF1（Oryza sativa-GROWTH-REGULATING FACTOR1）参与赤霉素诱导的茎伸长。在玉米中，也已经分离出几个与赤霉素相关的突变体，包括dwarf1（d1）、d3、d5、anther ear1（an1）以及显性突变体D8和D9。所有这些突变体都影响玉米生命周期中的节间伸长。矮化突变体gif1的窄叶和短节间与叶片和茎中未分化细胞数量的减少有关。brachytic plant1（bv1）的短节间和发育不良的节间细胞都与生长素运输不足有关。同样，矮化突变体brachytic2（br2）的下部节间缩短是由于生长素从茎和根分生组织外流减少。BLH12/14是KNOTTED1（KN1）的辅助因子，通过与KN1的相互作用维持节间分生组织并防止节间过早分化。

生长素作为一种调节细胞分裂、细胞伸长和细胞分化的重要植物激素，几乎在植物生长发育的所有阶段都发挥作用（马和 Grones，2018）。由生长素外排载体如 PINFORMEDS （PINs）和生长素内流载体如 AUXIN/LIKE AUXIN （AUX/LAX）介导的极性生长素转运，参与各种植物的生长和发育（Carraro et al.， 2006）。PIN1 作为生长素外排载体，是 SAM 中生长素分布的主要调节因子（Carraro et al.， 2006;de Reuille et al.， 2006）。ZmPIN1 在早期叶原基的表达降低导致叶起始延迟、SAM 扩大和异常叶序 1 （abph1，也称为 abphyl1）的叶状改变（Lee et al.， 2009）。此外，生长素信号因子（ARF）还通过上调或下调特定靶基因来促进细胞扩增、细胞分裂和细胞壁重构（Chandler， 2016）。小生长素上升RNA（SAUR）基因家族包括影响生长素水平和生长素极性运输的植物特异性细胞效应子（任和Gray，2015; Stortenbeker 和 Bemer，2019 年）。大多数 SAUR 基因，包括 AtSAUR10、AtSAUR19/63 和 AtSAUR32/50，都被充分证明通过增强 H-ATP 酶活性和细胞伸长来促进拟南芥上胚轴生长（Bemer等人，2017 年;Spartz等人，2014 年;Stortenbeker 和 Bemer，2019 年）。

尽管已经确定几个玉米基因是闰间分生组织形成和节间细胞扩增的调节因子（Ballesteros等人，2013 年;Tsuda et al.， 2017;Zhang， Sun， et al.， 2018），潜在的分子机制仍然难以捉摸。因此，我们对 EMS 诱导的玉米突变体文库进行了高通量筛选，并鉴定了节间较短且节点数增加的矮小突变体 zm66。进一步的研究表明，zm66 的矮小表型是由 ZmTE1 突变引起的，该突变已被证明编码玉米高度调节的关键因素（Veit et al.， 1998）。表征不佳的 ZmTE1 蛋白与粟酒裂殖酵母减数分裂诱导剂 2 （Mei2）高度相似，后者编码包含三个保守 RNA 识别基序（RRM）的 RNA 结合蛋白。据报道，Mei2 通过促进减数分裂前 DNA 合成来促进酵母细胞中的减数分裂（Watanabe and Yamamoto， 1994）。相反，Pat1 激酶磷酸化 Mei2，从而抑制从有丝分裂到减数分裂的转变（Watanabe et al.， 1997）。在本研究中，我们确定了 ZmTE1 在维持闰间分生组织形成、节间细胞伸长和株高调节中的决定性作用。ZmPP2Ac-2 和 ZmWEE1 可能调节 ZmTE1 的磷酸化和亚细胞定位，从而影响细胞分裂、细胞伸长和株高。

结果

ZmTE1 对玉米株高至关重要

玉米的高度由节点数量和节间长度决定，这两者与节间分生组织的形成和节间细胞的伸长密切相关[^Tsuda et al., 2017^; ^Zhang et al., 2019^; ^Zhang, Sun, et al., 2018^]。为了阐明节间分生组织形成和节间细胞伸长的分子机制，我们筛选了一个玉米EMS诱导的突变体库，并鉴定出一个矮化突变体zm66（图1a, b）。除了矮化特征外，该突变体还表现出雄穗雌性化，进一步导致类似果穗的外观以及在正常雄穗位置形成种子（图1c, d），并且每株的种子大小和重量显著降低（图1e, f）。该突变体与自交系B73（以下称为野生型WT）回交，以去除与表型无关的变化。zm66 × B73的F2代在株高上表现出3:1（高/矮）的表型分离比例（图1g），表明zm66的矮化表型是由一个隐性单基因引起的。
为了确定zm66的突变位点，我们从zm66 × B73 F2群体中表现出突变表型的40株幼苗中，通过基于外显子捕获的MutMap（EcMutMap）分析[^Lu et al., 2018^]获得了28,594个单核苷酸多态性（SNPs；Excel S1）（图1i）。经过筛选，鉴定出10,687个转换突变（即G-A或C-T），其中包括315个高质量评分的SNPs（次要等位基因频率≥90%）。其中，四个SNPs（SNP177676403、SNP-165174753、SNP-154716744和SNP138739421）对应于第3染色体编码区的非同义突变，并与突变体相关，重组频率分别为13.4%、0.0%、10.0%和13.8%（图1i）。SNP-165174753被定义为ZmTE1（GRMZM2G085113）基因，该基因的重组频率为0%，并且是矮化表型的原因。ZmTE1基因的第一个外显子中547 bp处的C到T的变化导致谷氨酰胺变为提前终止密码子（图1i, j）。此前，ZmTE1被报道在防止叶片过早发起和发育中起着关键作用[^Veit et al., 1998^{]，这与zm66突变体中叶片数量增加的表型一致（图1h）。因此，我们将zm66重新命名为zmte1-2，以区别于之前鉴定的zmte1-1[}Veit et al., 1998^]。我们将zmte1-1等位基因与zmte1-2杂交（图1k）。zmte1-1/zmte1-2的F1代也表现出与zmte1-1和zmte1-2相似的矮化表型（图1k, l），这表明zmte1-2的株高表型是由ZmTE1功能丧失引起的。

ZmTE1 是一种RNA结合蛋白，包含三个RNA识别基序（RRM1、RRM2和RRM3），并且与裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的Mei2、水稻（Oryza sativa）的LHD2/PLA2/OML1以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtTEL1/AtTEL2具有高度同源性[^Jeffares et al., 2004^; ^Kawakatsu et al., 2006^]。为了更好地理解Mei2类蛋白的进化关系，我们基于裂殖酵母、玉米（Zea mays）、水稻和拟南芥中的Mei2类蛋白构建了一个系统发育树。我们在玉米中发现了9个Mei2类蛋白，水稻中有7个，拟南芥中有8个（图S1）。尽管玉米中有9个Mei2类蛋白，但ZmTE1的缺失会导致矮化表型（图1a, b），这表明其在植物生长调控中具有关键作用。ZmTE1在几乎所有的玉米组织中都有表达（图1m），这进一步表明其在多种组织中的功能重要性。值得注意的是，ZmTE1在节间和叶片中的表达相对较高（图1m），这进一步表明zmte1-2植株的叶片和茎的发育异常是由ZmTE1功能丧失引起的。
在这里插入图片描述 zm66突变体的分离与定位。
(a) 在营养生长阶段，zm66表现出矮化表型。
(b) zm66与野生型（WT）相比的生长趋势。
© 成熟的野生型（WT）和zm66的果穗附着方式。
(d) 野生型（WT）和zm66突变体的成熟果穗表型。
(e) 野生型（WT）和zm66的种子大小。
(f) 野生型（WT）和zm66的成熟种子重量统计。平均值 ± 标准差（单因素方差分析，P < 0.05；n ≥ 15）。
(g) 从zm66 × 野生型（WT，B73）杂交的F2代植株的株高表型。
(h) 60天大的野生型（WT）、zmte1-1和zm66植株的叶片数量。数据以平均值 ± 标准误表示（单因素方差分析，P < 0.05；n ≥ 20）。
(i) 基于外显子捕获的MutMap分析和zm66突变体的突变位点分析。百分比表示SNP突变位点与控制zm66矮化表型的编码基因之间的连锁关系：数值越小，连锁关系越强。更详细的描述请参见材料与方法部分。
(j) zmte1-1和zmte1-2突变的示意图。
(k) 60天大的野生型（WT）、zmte1-1、zmte1-2和zmte1-1/zmte1-2突变体F1代植株的株高表型。
(l) 60天大的野生型（WT）、zmte1-1、zmte1-2和F1代zmte1-1/zmte1-2植株的株高统计。平均值 ± 标准误（单因素方差分析，P < 0.05；n ≥ 20）。
(m) 两周龄野生型（WT）的主根、胚根、冠根、冠根节点、胚轴和顶端分生组织以及六周龄野生型（WT）植株的节点、节间、叶片、果穗和雄穗中ZmTE1的相对表达量。

ZmTE1 通过加速细胞伸长促进节间伸长

成熟zmte1-1和zmte1-2植株的株高分别降低了33%和50%（图1l）。我们发现zmte1突变体的节间变短，这是株高降低的原因（图2a, b）。zmte1-1和zmte1-2的所有节间都比野生型（WT）短，其中第10、11、12和13节间受影响最为显著（图2b；图S2）。此外，与其他重要农艺性状一样，zmte1突变体的叶片数量、叶片大小和节间长度也发生了变化（图1h，图2a-c）。特别是果穗叶的最大宽度和长度受到影响，分别减少了47%、36%和32%、46%（图2c-e）。

先前的研究表明，节间长度主要取决于节间细胞的伸长（Tsuda et al., 2017），这表明ZmTE1可能正向调控节间细胞的伸长。不幸的是，由于节点的纤维化程度很高，我们无法获得良好的茎组织切片，因此无法直接检测节间细胞的长度。由于zmte1-1和zmte1-2突变体的叶片也显著小于野生型（WT）（图2c-e），我们检查了下表皮细胞的形态（图2f），发现这些细胞在zmte1-1和zmte1-2突变体中比野生型更小（图2f, g）。位于根和茎之间的胚轴主要负责将幼苗推出土壤（Saab and Ho, 1995），其生长类似于拟南芥的下胚轴，即与细胞伸长相关（Kutschera and Wang, 2016）。zmte1-1和zmte1-2植株的胚轴发育也明显落后于野生型（图2h, i），这进一步证实了ZmTE1促进细胞伸长。鉴于zmte1-1和zmte1-2的叶片缩小和胚轴缩短都是由于细胞伸长受限，且节间伸长与细胞伸长相关（Tsuda et al., 2017），我们假设ZmTE1通过促进节间细胞的伸长来增加节间长度。

ZmTE1维持节间分生组织的形成和细胞分裂

除了节间长度外，节点的数量也决定了植物茎的高度[^Zhang, Sun, et al., 2018^]。令人惊讶的是，矮化突变体zmte1-1和zmte1-2的节点数量比野生型（WT）多50%（图2a, 3a），这表明ZmTE1可能在节点形成调控中也起着重要作用。此外，zmte1-1和zmte1-2突变体植株在幼苗阶段的节点数量显著增加（图3b）。这一结果表明，成熟阶段出现的增加的节点数量是由于幼苗阶段节点形成的加速。通过对20天大植株的茎进行组织切片分析，我们发现zmte1-1和zmte1-2植株的初始节间伸长出现在第八和第九片叶之间。这一时间点早于野生型，野生型的节间伸长开始于第七和第八片叶之间（图3c）。因此，节点形成的加速缓解了zmte1-1和zmte1-2突变体在早期生长中由于细胞伸长减少而导致的茎生长减缓。

KN1 在顶端分生组织（SAM）和节间分生组织中特异性表达[^Tsuda et al., 2017^{]，通常用于确定分生组织的位置和面积。然而，RNA原位杂交结果显示，zmte1-2的分生组织区域显著小于野生型（WT）（图3d）。我们的数据表明，ZmTE1促进了分生组织中的细胞分裂，因为分生组织的大小主要取决于细胞数量[}Zhang, Sun, et al., 2018^{]。此外，野生型茎中的规则分层结构逐渐发育成节间分生组织[}Tsuda et al., 2017^]。相比之下，zmte1-2茎的结构紊乱（图3d, e），这表明ZmTE1在节间分生组织的有序形成中也起着关键作用。因此，zmte1-2植株中ZmTE1调控的缺失导致节间分生组织的任意形成和随后节点的过度形成（图3a）。综合来看，ZmTE1在促进分生组织中的细胞分裂和维持节间分生组织形成以实现完全生长潜力方面发挥双重作用。

ZmTE1正向调控生长素信号传导

为了更深入地理解ZmTE1介导的细胞伸长和细胞分裂，我们对28天大的野生型（WT）和zmte1-2植株的节点和节间进行了RNA测序（RNA-seq）。与野生型相比，zmte1-2节点中有5,546个差异表达基因（DEGs；P值 ≤ 0.05且变化倍数 ≥ 2）（Excel S2）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，差异表达基因数据集中有200个与生长素信号相关的基因（图S3）。鉴于生长素在调控细胞伸长和细胞分裂中的重要作用[^Du and Spalding, 2020^]，zmte1-2中下调的生长素信号基因簇（图4a）可能促成了这些突变体的发育表型。

Aux/IAAs和SAURs是生长素快速诱导基因[^Abel and Theologis, 1996^]，通常被用作生长素信号响应的标记基因。在随后的详细qRT验证实验中，所有这些基因在zmte1-2中均显著下调（图4b），证实了zmte1-2中生长素信号响应的降低。更直接地，我们将玉米DR5 rev:RFP（生长素响应标记）引入zmte1-2，以直观观察顶端分生组织（SAM）中的生长素信号强度。结果显示，zmte1-2中的RFP荧光强度显著降低（图4c），表明ZmTE1在维持顶端分生组织中基本的生长素信号方面发挥重要作用。为了进一步确认ZmTE1对生长素信号的正向调控，我们验证了在zmte1-2中，高浓度生长素对根伸长的抑制是否减弱。与我们的假设一致，当ZmTE1功能丧失时，生长素介导的根伸长抑制显著减少（图4d），这进一步强化了ZmTE1在生长素信号中的重要作用。值得一提的是，一些生长素运输基因在zmte1-2突变体植株中也显著减少（图4b），这表明ZmTE1可能通过调控生长素运输来增强生长素信号。具体来说，PIN1已被报道在顶端分生组织发育过程中调节生长素分布方面发挥重要作用[^Carraro et al., 2006^]。zmte1-2中PIN1表达的下调表明，顶端分生组织的异常发育可能是由于生长素分布的破坏和生长素信号的不足（图4b）。在野生型（WT）和zmte1-2之间，生长素合成基因的表达没有显著差异（Excel S2），这表明ZmTE1介导的生长素信号调控可能独立于生长素合成。总之，ZmTE1正向调控生长素信号。

ZmTE1调控细胞分裂和细胞伸长相关基因的表达

为了进一步探究zmte1-2中细胞分裂和细胞伸长缺陷背后的分子机制，我们仔细重新分析了RNA-seq数据。许多细胞周期相关基因，包括CYCAs、CYCBs和CDKs，在zmte1-2中显著下调（图S4a）。这一结果表明，正常的分生组织细胞分裂需要维持ZmTE1，这与在zmte1-2中观察到的分生组织发育缺陷一致（图3d）。与zmte1-2中的细胞伸长缺陷一致，与细胞伸长相关的基因，包括SAURs、EXPANSIONs和EXTs，也显示出在zmte1-2中显著降低的表达（图4b；图S4b）。此外，一些负向调控细胞伸长的基因，如过氧化物酶（PERs）[^Knoller et al., 2010^]，显著上调（图S4b）。这些结果表明，ZmTE1是细胞伸长所必需的维持因子，这与在zmte1-2中观察到的节间和胚轴缩短一致（图2a, h）。已有充分证据表明，生长素可以通过上调SAURs、EXPANSIONs和EXTs的表达[^Du et al., 2020^{]，以及下调PERs的表达[}Knoller et al., 2010^]来促进细胞伸长，这支持了生长素信号对于ZmTE1诱导的细胞伸长至关重要的观点。总之，ZmTE1通过生长素介导的细胞分裂和细胞伸长的调控来维持分生组织的形成和节间伸长。

ZmTE1与ZmPP2Ac-2和ZmWEE1互作

为了进一步阐明ZmTE1如何调控细胞伸长、细胞分裂和节间分生组织的形成，我们使用ZmTE1作为诱饵蛋白筛选了玉米cDNA文库。我们鉴定出四个与ZmTE1互作的蛋白，分别是ZmMBR1、ZmARF32、ZmWEE1和ZmPP2Ac-2（图5a）。AtMBR1（GRMZM2G165044，在本研究中命名为ZmMBR1）是E3泛素连接酶AtMED25-BINDING RING-H2 PROTEIN1的同源物，已被报道参与促进开花[^Inigo et al., 2012^{]。ZmARF32是转录因子AtARF17的同源物，作为ZmTE1的结合伙伴。AtARF17已被报道在花药开裂和花粉壁模式形成中起关键作用[}Xu et al., 2019^{]。这两种蛋白可能与节间细胞伸长或分生组织中的细胞分裂无关。ZmWEE1是WEE1激酶的同源物，WEE1激酶作为细胞周期G2/M检查点，在DNA复制应激时抑制细胞周期的进行[}Velappan and Signorelli, 2017^{]，并且是ZmTE1的潜在结合伙伴之一。此外，我们还发现ZmPP2Ac-2基于酵母双杂交分析与ZmTE1互作。ZmPP2Ac-2与植物磷酸酶AtPP2A-C3和AtPP2A-C4同源，通过去磷酸化促进PIN1的极性定位，从而促进生长素的极性运输[}Ballesteros et al., 2013^]。这些磷酸酶已被报道调控细胞伸长和分生组织的形成。我们还通过双分子荧光互补（BiFC）和共免疫沉淀（CoIP）实验在烟草叶片表皮细胞中验证了ZmTE1与ZmWEE1和ZmPP2Ac-2的互作（图5b, c）。

材料与方法

矮化突变体筛选与ZmTE1基因鉴定

从(Lu et al., 2018)获得的约12,000个EMS诱导的玉米突变体中，我们在田间筛选了包括株高在内的表型。筛选出一个矮化突变体zm66（zmte1-2），并将其与野生型B73回交。F1代植株自交后，F2代植株在田间生长，80天大时测量株高。我们还将zmte1-2与突变体库[^{https://www.maizegdb.org/}]中的zmte1-1杂交，根据F1代植株的表型检查等位性。基于外显子捕获的MutMap（EcMutMap）[^Lu et al., 2018^{]是MutMap方法的改进版，MutMap是通过将突变体与野生型杂交在水稻中快速鉴定基因的方法[}Abe et al., 2012^; ^Takagi et al., 2013^{]。简言之，我们提取了40株表现出矮化表型的**F2代幼苗的DNA**，使用CTAB法提取DNA后以等摩尔比混合，然后通过GAIIx设备（Illumina）进行EcMutMap分析。使用MAQ软件[}Li and Ruan, 2008^{]将过滤后的测序读段比对到野生型参考序列上。通过测序每个模板的扩增子并计算交叉率[}Zhang, Lu, et al., 2018^]来验证多态性。当变异位点与一对G/A或C/T峰相关时，推断其中一个同源染色体发生了交叉；一个对应于G或C的单峰被解释为两个同源染色体都发生了交叉，而一个A或T的单峰则表明没有发生交叉。计算每个突变体的交叉率（G/G+A或C/C+T）。与矮化表型无关或位于不同染色体上的突变体预计会以1:1的比例分离；那些完全与致病位点连锁的突变体则不预期与表型分离。位于同一染色体（本研究为第3染色体）上且与致病位点连锁的变异位点预计会部分连锁。通过在每个突变体中重新测序获得ZmTE1的等位基因状态，用于此分析的引物列于表S1。

主根对外源NAA处理的响应

野生型（WT）和zmte1-2种子用5%（W/V）次氯酸钠（NaClO）表面消毒30分钟，然后用无菌水冲洗三次。之后，种子在28°C/25°C（昼/夜）的培养箱中进行水培，相对湿度约为60%，光周期为16小时光照/8小时黑暗（~100 µmol m⁻² s⁻¹）。培养液为0.5×霍格兰德液体溶液 [0.51 g/L KNO₃, 0.82 g/L Ca(NO₃)₂, 0.49 g/L MgSO₄·7H₂O, 0.136 g/L KH₂PO₄, 0.6 mg/L FeSO₄, 2.86 mg/L H₃BO₃, 1.81 mg/L MnCl₂·4H₂O, 0.08 mg/L CuSO₄·5H₂O, 0.22 mg/L ZnSO₄·7H₂O, 0.09 mg/L H₂MoO₄·4H₂O]，每两天更换一次。三天大的幼苗主根长度约为5厘米，用100 nM NAA处理48小时。

系统发育分析

为了构建系统发育树，我们使用ClustalX（Yu et al., 2020）对裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）和拟南芥中的Mei2类蛋白进行了比对。基于比对结果，使用MEGA7中的邻接法（neighbour-joining method）构建了系统发育树。

表型分析与细胞学观察

对zmte1突变体的表型进行了详细分析，记录了株高、节点数量和长度、叶片大小和数量、胚轴长度以及种子的大小和重量。为了测量细胞大小，分别从zmte1-1、zmte1-2和野生型（WT）的果穗位置的成熟叶片中取样。使用Olympus BX53显微镜观察叶片中央区域的下表皮细胞。每片叶子观察三个视野，每个视野测量约30个细胞。五片叶子测量的细胞平均长度用于代表每种基因型的细胞大小，细胞大小通过Image J软件计算。

RNA-Seq、qRT-PCR和组织表达模式分析

收集四周大的野生型（WT）和zmte1-2突变体的最后一根支持根的三个节点，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行RNA分离。纯化的RNA被送往中国深圳的BGI进行RNA-seq分析。使用P值 ≤ 0.05和|log2| ≥ 1的阈值来鉴定差异表达基因。为了在顶端分生组织（SAM）中可视化生长素信号响应，将携带DR5 rev:RFP（Gallavotti et al., 2008）的玉米转基因标记品系与zmte1-2突变体杂交，并对两周大的DR5 rev:RFP/zmte1-2和DR5 rev:RFP/WT幼苗进行RFP信号强度扫描。
为了分析ZmTE1在不同玉米组织中的表达，从野生型植株中收集了两周大的主根、胚根、冠根、冠根节间、胚轴、SAM，以及六周大的支持根、三个节点和节间、叶片、雄穗和果穗。使用TRIzol试剂从不同组织中提取RNA，并使用qRT-PCR分析ZmTE1在不同组织中的表达。对于qRT-PCR，从WT和zmte1-2的节点中分离RNA，并使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit（Roche，Basel，Switzerland）进行逆转录，按照制造商的协议操作。qRT-PCR在MyiQ™ Real-time PCR Detection System（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上进行，使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Q411，Vazyme，Nanjing，China）。ZmACTIN和ZmGAPDH基因作为参考对照。用于qRT-PCR的引物列于表S1。

石蜡切片和原位杂交

14天大的zmte1和野生型（WT）植株的顶端分生组织（SAM）在含有4%多聚甲醛的溶液中固定16小时，温度为4°C。然后用1×PBS洗涤两次，并通过乙醇系列脱水，随后用二甲苯置换，用Paraplast Plus（Sigma-Aldrich）包埋，并切成8毫米厚的切片。植物组织切片用甲苯蓝染色进行组织学观察，切片图像使用Olympus BX53显微镜拍摄。
原位杂交按照先前的描述进行[^Zhou et al., 2011^]。简而言之，我们构建了正义和反义RNA探针，如下所示。使用针对ZmTE1和ZmKN1的引物集分别扩增461 bp和570 bp的片段，然后将这些片段克隆到pSPT18载体中，并分别用HindIII和EcoRI线性化。然后分别使用SP6和T7 RNA聚合酶合成正义和反义探针，以地高辛（地高辛-11-UTP，Roche Diagnostics）作为标记。最后，按照先前的研究[^Zhou et al., 2011^]，准备标准石蜡切片并进行原位杂交。

酵母双杂交筛选cDNA文库和蛋白互作验证

从14天大的野生型（WT）幼苗中提取总RNA，并在DNaseI处理后去除基因组DNA。使用SMART cDNA文库构建试剂盒（Clontech）合成cDNA，并将cDNA送至日本Takara（大阪）构建cDNA文库。酵母双杂交实验按照制造商手册和Matchmaker GAL4酵母双杂交系统3（Takara，大阪，日本）进行。将ZmTE1的CDS克隆到诱饵质粒pGBKT7（BD）中，并按照制造商的说明进行酵母双杂交筛选。为了验证鉴定出的蛋白-蛋白互作，将候选基因的CDS克隆到pGADT7（AD）中。BD-ZmTE1和AD-候选融合蛋白（使用空载体作为阴性对照）一起通过PEG/LiAc方法转化到酵母Y2HGold中。在缺乏色氨酸和亮氨酸（-LW）的合成平板培养基（SD培养基）上培养两天后，将转化子转移到缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸（-LWH）以及缺乏色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤（-LWAH）的SD培养基上，再培养三到四天。本实验中使用的引物列于表S1。

共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation）

将ZmWEE1、ZmPP2Ac-2和ZmTE1基因分别克隆到pCAMBIA1390-7Myc-6HIS或pEareyGate 101-YFP载体中，分别生成35S::ZmTE1-Myc、35S::ZmTE1-YFP、35S::ZmPP2Ac-2-Myc和35S::ZmWEE1-YFP质粒。随后，将这些构建转化到拟南芥叶肉细胞中进行瞬时蛋白表达。共免疫沉淀（Co-IP）实验按照先前的研究[^Lv et al., 2020^]进行。简言之，收集拟南芥叶肉细胞并在冰上用细胞裂解缓冲液（0.5 mM EDTA；10 mM Tris-HCl；pH 7.5；0.5% NP-40；1 mM PMSF；150 mM NaCl）裂解30分钟，每10分钟轻轻吹打一次。细胞裂解液经离心后，上清液与MYC-Trap磁性琼脂糖珠（Chromotek，产品编号ytma20，德国）在4°C下孵育2小时。用稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl；pH 7.5；150 mM NaCl；0.5 mM EDTA）洗涤珠子三次，然后重悬于SDS上样缓冲液中。重悬的珠子煮沸10分钟，随后用抗-MYC（Abclonal，产品编号AE010，武汉，中国）或抗-GFP（TransGen Biotech，产品编号HT801-02，北京，中国）抗体进行Western blotting分析。

双分子荧光互补和亚细胞定位分析

为了进行双分子荧光互补（BiFC）实验，我们分别将ZmPP2Ac-2、ZmWEE1和ZmTE1的全长CDS扩增并克隆到p2YN和2YC载体中，通过PacI和AscI线性化后分别与YFP的N端和C端融合。将这些质粒转化到农杆菌GV3101菌株中，并用MMA培养基（50 mM MES，10 mM MgCl₂，20 µM乙酰丁香酮，pH 5.6）注射到四周大的本氏烟叶片中进行瞬时蛋白表达[^Yu et al., 2019^]。然后，使用Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss，德国）在488 nm处对烟草表皮细胞进行成像。每种组合分析了三个生物学重复，以空载体组合作为阴性对照。对于亚细胞定位分析，我们将ZmPP2Ac-2、ZmWEE1和ZmTE1的CDS克隆到pB7WGF2载体中，通过LR反应生成35S::GFP-ZmPP2Ac-2、35S::GFP-ZmWEE1和35S::GFP-ZmTE1构建。随后，将携带35S::GFP-ZmPP2Ac-2、35S::GFP-ZmWEE1或35S::GFP-ZmTE1的GV3101与携带BZR1p:BZR1-RFP（作为细胞核和细胞质定位标记）的GV3101一起转化到本氏烟叶片中。使用Zeiss LSM 880共聚焦显微镜（Zeiss，德国）评估荧光

体内磷酸化和去磷酸化实验

为了确定ZmWEE1和ZmPP2Ac-2是否影响ZmTE1的磷酸化状态，我们将GFP-ZmTE1、ZmWEE1-MYC和ZmPP2Ac-2-MYC转化到拟南芥叶肉原生质体中。原生质体被收集并在冰上用细胞裂解缓冲液（0.5 mM EDTA；10 mM Tris-HCl；pH 7.5；0.5% NP-40；1 mM PMSF；150 mM NaCl）裂解30分钟，每10分钟轻轻吹打一次。细胞裂解液经离心后，ZmTE1的上清液与ZmWEE1一起用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）在30°C下处理30分钟。最后，将上清液在99°C下煮沸10分钟。使用Phos-tag（Yu et al., 2019）分离和检测磷酸化和去磷酸化的TE1。使用抗-GFP抗体（TransGen Biotech，产品编号HT801-02）检测ZmTE1的蛋白水平和磷酸化状态；使用抗-MYC抗体（Abclonal，产品编号AE010）检测ZmWEE1-MYC和ZmPP2Ac-2-MYC的蛋白水平。