AbMole|新型环状RNA circCGNL1在胰腺癌进展中的作用及其分子机制的实验研究

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 胰腺癌（Pancreatic Cancer, PC）是一种高度恶性的肿瘤，具有低生存率和高死亡率的特点。由于缺乏有效的生物标志物和治疗靶点，胰腺癌的治疗一直面临巨大挑战。近年来，环状RNA（circRNA）在癌症发生发展中的作用逐渐受到关注。

由中国南京医科大学第一附属医院胰腺中心普外科的Hao Yuan, Chuang Chen, Haonan Li 等人发表了名为《Role of a novel circRNA-CGNL1 in regulating pancreatic cancer progression via NUDT4–HDAC4–RUNX2–GAMT-mediated apoptosis》的文章，本文主要描述了一项关于新型环状RNA circCGNL1（hsa_circ_0035435）在胰腺癌中的功能及其分子机制的实验研究结果。其中使用了AbMole的CCK-8（M4839）产品。

首先，研究团队通过qRT-PCR技术检测了circCGNL1在胰腺癌细胞系和组织中的表达水平。结果显示，与正常胰腺细胞和组织相比，circCGNL1在胰腺癌细胞和组织中的表达显著下调。这一发现提示circCGNL1可能在胰腺癌中发挥抑癌作用。

为了进一步验证circCGNL1的稳定性，研究团队进行了RNase R和放线菌素D处理实验。结果表明，circCGNL1能够抵抗这两种酶的降解，显示出比线性CGNL1更高的稳定性。这一特性为circCGNL1作为潜在生物标志物的应用提供了基础。    

图1 PC细胞和组织中circCGNL1的鉴定和特性。

为了明确circCGNL1在胰腺癌细胞中的功能，研究团队进行了一系列功能实验。首先，通过质粒转染技术在胰腺癌细胞系PANC-1和BxPC-3中过表达circCGNL1，并通过CCK-8和EdU增殖实验检测细胞增殖能力。结果显示，circCGNL1过表达显著抑制了胰腺癌细胞的增殖。    

接着，研究团队通过TUNEL、DAPI染色、流式细胞术和透射电镜等多种方法检测了circCGNL1对胰腺癌细胞凋亡的影响。结果表明，circCGNL1过表达显著促进了胰腺癌细胞的凋亡，表现为TUNEL阳性细胞比例增加、DAPI染色下细胞核形态改变以及透射电镜下凋亡小体的形成。

图2 circCGNL1抑制PC细胞增殖，促进PC细胞凋亡。    

为了揭示circCGNL1发挥抑癌作用的分子机制，研究团队进行了RNA pulldown和质谱分析，鉴定出与circCGNL1相互作用的蛋白质。结果显示，磷酸酶NUDT4是circCGNL1的一个重要结合蛋白。进一步实验表明，circCGNL1与NUDT4的Nudix水解酶结构域结合，且这种结合不依赖于miRNA海绵作用。

图3 circCGNL1 与 PC 细胞中的 NUDT4 蛋白发生物理相互作用。

NUDT4作为一种磷酸酶，能够调控其下游靶蛋白的磷酸化状态。研究团队通过Co-IP和GST pulldown实验发现，NUDT4能够促进组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）在Ser632位点的去磷酸化。进一步实验表明，circCGNL1通过招募NUDT4增强了HDAC4的去磷酸化过程，并促进了HDAC4的核转位。这一发现揭示了circCGNL1通过NUDT4调控HDAC4定位的新机制。    

图4 NUDT4 调节 HDAC4 蛋白的去磷酸化。

核内的HDAC4能够介导RUNX2（RUNX Family Transcription Factor 2）的去乙酰化和降解。研究团队通过Co-IP实验验证了HDAC4与RUNX2的相互作用，并发现circCGNL1过表达降低了RUNX2的乙酰化水平和表达量。进一步分析表明，RUNX2作为转录因子能够结合到GAMT（guanidinoacetate N-methyltransferase）的启动子上抑制其表达。因此，circCGNL1通过HDAC4-RUNX2轴间接上调了GAMT的表达。    

图5 circCGNL1 通过与 NUDT4 相互作用增强 HDAC4 去磷酸化。    

GAMT是一种在肌酸生物合成途径中发挥重要作用的酶。研究团队发现，GAMT在胰腺癌细胞中的表达显著下调。通过过表达GAMT并检测相关凋亡信号通路蛋白的表达水平，发现GAMT能够激活AMPK并抑制AKT和Bad的磷酸化，进而诱导胰腺癌细胞的凋亡。这一过程涉及caspase-3的切割和活化，最终导致细胞凋亡。

图6 circCGNL1 促进 HDAC4 诱导的 RUNX2 去乙酰化和不稳定。    

为了在体内验证circCGNL1的抑癌作用，研究团队构建了circCGNL1过表达的稳定转染细胞系，并将其注射到裸鼠皮下进行成瘤实验。结果显示，circCGNL1过表达显著抑制了胰腺癌细胞的肿瘤生长，表现为肿瘤体积和重量的减小。进一步通过免疫组化分析发现，circCGNL1过表达组中Ki67和PCNA（增殖细胞核抗原）的表达降低，而cleaved caspase-3的表达增加。这些结果证实了circCGNL1在体内的抑癌作用。    

图7 RUNX2 转录抑制 GAMT 表达。

最后，研究团队收集了胰腺癌患者的临床样本，并通过qRT-PCR检测了circCGNL1的表达水平。结果显示，circCGNL1低表达的患者预后较差。进一步通过单因素和多因素Cox回归分析发现，circCGNL1是胰腺癌患者的独立预后因素之一。这一发现为circCGNL1作为胰腺癌预后标志物提供了临床证据。  

图8 circCGNL1 在体内抑制 PC 肿瘤生长。

综上所述，本研究揭示了新型环状RNA circCGNL1在胰腺癌中的重要作用及其分子机制。circCGNL1通过NUDT4–HDAC4–RUNX2–GAMT途径调控胰腺癌细胞的凋亡过程，从而抑制肿瘤的生长和进展。这一发现为胰腺癌的治疗提供了新的靶点和策略，具有重要的临床意义和科学价值。