AbMole|Exosomal circLPAR1在结直肠癌诊断和肿瘤发生中的作用及其机制研究

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结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一。据统计，2020年全球新增结直肠癌病例超过190万例，死亡病例超过93.5万例。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率近年来居高不下，对公共卫生构成严重威胁。尽管已有多种临床手段用于结直肠癌的筛查和诊断，如结肠镜检查、乙状结肠镜检查和粪便检测等，但早期检测和诊断结直肠癌仍然面临诸多挑战。因此，寻找新的生物标志物以提高结直肠癌的早期诊断率成为当前研究的热点。

由南京医科大学公共卫生学院Rui Zheng , Ke Zhang , Shanyue Tan 等人发表的名为“Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis  through suppressing BRD4 via METTL3–eIF3h interaction”的文章，文章通过高通量RNA测序技术鉴定结直肠癌特异性外泌体circRNA，评估其在结直肠癌诊断中的性能，并探讨了其在结直肠癌发生发展中的作用机制。其中使用了AbMole的Actinomycin D（M4881）产品。

近年来，外泌体作为细胞间通讯的重要载体，因其携带丰富的生物分子信息，被认为是潜在的生物标志物来源。外泌体是直径在40-120纳米之间的纳米级囊泡，广泛存在于体液中，如血液、尿液和脑脊液等。外泌体内部包含蛋白质、核酸（如mRNA、miRNA和circRNA）和脂质等多种生物活性分子，这些分子在细胞间通讯和疾病进展中发挥着重要作用。特别是circRNA，由于其独特的环状结构，相比线性RNA更为稳定，且易于在体液中检测到，因此成为疾病诊断和预后评估的新宠。   

本研究从南京结直肠癌队列中随机选取了112名结直肠癌患者、28名息肉患者和60名健康对照者。同时，还收集了胃癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肾癌和肺癌等其他类型癌症患者的血浆样本作为对照。

其中对52对结直肠癌组织及其邻近正常组织进行RNA测序，鉴定差异表达的circRNA。同时，对25对结直肠癌组织及其邻近正常组织进行基于串联质谱标签（TMT）的定量蛋白质组学分析。使用ExoQuick试剂盒从细胞培养液和血浆中分离外泌体，并通过纳米流式细胞仪和透射电镜对外泌体的形态和大小进行表征。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和荧光原位杂交（FISH）检测circLPAR1在组织、细胞和外泌体中的表达。

使用RNase R和放线菌素D处理细胞，评估circLPAR1的稳定性。在细胞模型中，通过转染circLPAR1过表达载体或外泌体，评估circLPAR1对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力的影响。在动物模型中，通过皮下注射稳定表达circLPAR1的细胞或其外泌体，评估circLPAR1对结直肠癌肿瘤生长的影响。使用circRNA下拉实验结合质谱分析，鉴定与circLPAR1相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）。通过RNA免疫沉淀（RIP）实验验证circLPAR1与eIF3h的相互作用，并探讨其对BRD4翻译的影响。

RNA测序结果显示，在结直肠癌组织中，hsa_circ_0087960（circLPAR1）的表达显著下调。FISH实验进一步证实，circLPAR1在结直肠癌组织中的表达水平明显低于邻近正常组织，且其低表达与结直肠癌患者的不良预后相关。在外泌体中，circLPAR1同样表现出稳定的下调趋势，且其在结直肠癌患者血浆外泌体中的水平显著低于健康对照者和其他类型癌症患者。    

图1：circLPAR1在结直肠癌组织和外泌体中的表达下调

ROC曲线分析显示，血浆外泌体circLPAR1在区分结直肠癌患者与健康对照者时表现出良好的诊断性能（AUC=0.858）。当与临床常用的肿瘤标志物CEA和CA19-9联合使用时，AUC值进一步提高至0.875，敏感性和特异性分别达到87.30%和76.30%。    

图2：circLPAR1在结直肠癌诊断中的性能评估

在细胞模型中，过表达circLPAR1显著抑制了结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力。同时，外泌体传递的circLPAR1同样表现出相似的抑制作用。

图3:circLPAR1抑制结直肠癌细胞恶性表型

circRNA下拉实验结合质谱分析鉴定出与circLPAR1相互作用的RBPs，其中eIF3h表现出最强的结合能力。RIP实验进一步验证了circLPAR1与eIF3h的直接相互作用。研究表明，circLPAR1作为eIF3h的“海绵”，阻断了METTL3-eIF3h复合物对BRD4 mRNA的翻译增强作用，从而抑制了BRD4的表达。BRD4是BET家族蛋白的一员，在多种癌症的发生发展中发挥重要作用。因此，circLPAR1通过抑制BRD4的翻译，进而抑制了结直肠癌的发生发展。    

图4：circLPAR1通过抑制BRD4翻译抑制结直肠癌发生

在裸鼠皮下成瘤模型中，注射过表达circLPAR1的细胞或其外泌体显著抑制了肿瘤的生长。肿瘤组织中的Ki67和BRD4表达水平明显降低，进一步证实了circLPAR1的抑瘤作用。    

图5：circLPAR1在动物模型中的抑瘤作用

本研究首次揭示了circLPAR1在结直肠癌诊断和发生发展中的重要作用及其分子机制。circLPAR1作为外泌体中的稳定分子标志物，不仅在结直肠癌患者血浆中表现出特异性下调趋势，而且在联合传统肿瘤标志物时显著提高了诊断性能。更重要的是，circLPAR1通过抑制BRD4的翻译抑制了结直肠癌的发生发展，为结直肠癌的靶向治疗提供了新的靶点。

未来研究可以进一步探讨circLPAR1在其他类型癌症中的作用及其分子机制，同时开发基于circLPAR1的检测方法和治疗手段，以期实现结直肠癌的早期诊断和精准治疗。此外，circLPAR1与其他生物标志物的联合应用也值得进一步探索，以提高结直肠癌的筛查和诊断效率。