AbMole|基于高容量腺病毒载体和 CRISPR-Cas9 核酸酶的大规模基因组编辑

 

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在医学科研的征程中，每一次重大的发现都如同照亮黑暗的明灯，为那些被疾病困扰的人们带来希望的曙光。一篇发表在《Nucleic Acids Research》的研究论文引起了广泛关注，这篇论文展示了一种基于高容量腺病毒载体（AdVPs）和 CRISPR-Cas9 核酸酶的大规模基因组编辑技术，为杜氏肌营养不良（DMD）的治疗带来了新的突破。

来自莱顿大学医学中心细胞与化学生物学系的Francesca Tasca, Marcella Brescia, Qian Wang等多名研究人员发表了题为《Large-scale genome editing based on high-capacity adenovectors and CRISPR-Cas9 nucleases rescues full-length dystrophin synthesis in DMD muscle cells》的研究成果。

在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的IWP-L6（目录号M2781）。

杜氏肌营养不良是一种由 DMD 基因突变引起的致死性、频繁的 X 连锁肌肉萎缩疾病。这种疾病给患者及其家庭带来了巨大的痛苦和负担。目前，大多数 DMD 定向基因疗法是突变特异性的，且只能产生部分功能的微抗肌萎缩蛋白或缩短的 Becker 样抗肌萎缩蛋白。然而，通过稳定表达全长抗肌萎缩蛋白来补充 DMD 致病突变有望提供更有效、更广泛适用的治疗方法。

在这项研究中，研究者们利用高容量腺病毒载体和 CRISPR-Cas9 核酸酶进行大规模基因组编辑。高容量腺病毒载体具有无病毒基因、包装容量大、遗传稳定性高、易于修改细胞嗜性以及能有效转导分裂和非分裂细胞等特点。这些特性使得 AdVPs 成为将较大的基因载荷插入难转染的干细胞和祖细胞中的理想载体。    

图 1.AdVP 的表征和测试，用于优化 AAVS1 靶向 RGN 复合物的一体化递送。

CRISPR-Cas9 核酸酶是一种强大的基因组编辑工具，它可以在特定的位点切割 DNA，从而实现对基因组的精确编辑。在这项研究中，研究者们利用 CRISPR-Cas9 核酸酶在 DMD 肌细胞中产生双链 DNA 断裂，然后将携带全长抗肌萎缩蛋白基因的 AdVPs 导入细胞中。通过同源重组，全长抗肌萎缩蛋白基因被插入到内源位点，从而实现了对 DMD 肌细胞的基因修复。    

图 2.挽救 AdVP 校正的DMD肌肉细胞中的全长抗肌萎缩蛋白合成。

为了验证这种方法的有效性，研究者们进行了一系列的实验。首先，他们在人宫颈癌细胞 HeLa 细胞、人野生型成肌细胞、DMD 缺陷型成肌细胞、DMD 缺陷型 iPSCs、野生型 iPSCs 以及 PEC3.30 AdVP 包装细胞和 HEK293T 细胞中进行了细胞培养。然后，他们构建了用于产生纤维修饰的 AdVPs 的分子克隆，包括编码与 EGFP 融合的人全长抗肌萎缩蛋白的构建体（EGFP::DYS）和含有合成的 436 - bp 横纹肌特异性 CK8 启动子的构建体等，并对产生的 AdVPs 进行了纯化和表征。    

接下来，研究者们利用慢病毒载体将 CRISPR-Cas9 核酸酶导入 DMD 缺陷型成肌细胞中，在细胞中产生双链 DNA 断裂。然后，他们将携带全长抗肌萎缩蛋白基因的 AdVPs 导入细胞中，通过同源重组，全长抗肌萎缩蛋白基因被插入到内源位点。实验结果表明，这种方法可以有效地修复 DMD 肌细胞中的致病突变，恢复全长抗肌萎缩蛋白的合成。

此外，研究者们还对这种方法的安全性进行了评估。他们发现，AdVPs 和 CRISPR-Cas9 核酸酶在细胞中的表达水平较低，不会引起明显的细胞毒性和免疫反应。这表明，这种方法具有较高的安全性，有望在临床治疗中得到应用。

这项研究为杜氏肌营养不良的治疗带来了新的希望。通过基于高容量腺病毒载体和 CRISPR-Cas9 核酸酶的大规模基因组编辑技术，研究者们成功地修复了 DMD 肌细胞中的致病突变，恢复了全长抗肌萎缩蛋白的合成。这种方法具有高效、安全、广泛适用等优点，有望成为未来 DMD 治疗的重要手段。

然而，这项研究也存在一些不足之处。例如，目前这种方法还处于实验室阶段，需要进一步进行动物实验和临床研究，以验证其安全性和有效性。此外，这种方法的成本较高，需要进一步降低成本，以便在临床治疗中得到广泛应用。

总之，这项研究为杜氏肌营养不良的治疗带来了新的希望。相信在研究者们的不断努力下，这种基于高容量腺病毒载体和 CRISPR-Cas9 核酸酶的大规模基因组编辑技术将会在未来的临床治疗中发挥重要作用，为那些被杜氏肌营养不良困扰的人们带来福音。