通过 CRISPR-Cas13靶向SPCSV-RNase3 赋予了对甘薯病毒病的抗性

摘要

赛思基因（www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。

甘薯（Ipomoea batatas）是世界上最重要的农作物之一，其产量主要因甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）和甘薯红薯病毒（SPCSV）共同感染引起的甘薯病毒病（SPVD）而降低。马铃薯羽状斑驳病毒。然而，尚未建立改善SPVD抗性的方法。因此，本研究旨在通过使用 CRISPR-Cas13 技术靶向其重要的发病机制相关因子之一（即 SPCSV-RNase3）来增强 SPVD 抗性。首先，在本氏烟草中使用瞬时表达系统比较了四种 CRISPR-Cas13 变体的 RNA 靶向活性. LwaCas13a 和 RfxCas13d 比 PspCas13b 和 LshCas13a 具有更有效的 RNA 和 RNA 病毒靶向活性。在 pCmYLCV 启动子的驱动下，RfxCas13d 表现出比 pAtU6 启动子更高的 RNA 靶向活性。此外，使用 LwaCas13a 系统靶向 SPCSV -RNase3抑制了其 RNA 沉默抑制活性并恢复了本氏烟草叶细胞中的 RNA 沉默活性。与野生型相比，携带RNase3靶向 LwaCas13a 系统的转基因本氏烟草植物对萝卜花叶病毒 TuMV-GFP 和黄瓜花叶病毒 CMV-RNase3 共感染表现出增强的抗性。此外，转基因甘薯植株携带以 RNase3 为目标的 RfxCas13d 系统表现出显着提高的 SPVD 抗性。该方法可能有助于SPVD免疫种质的开发和SPVD高发地区甘薯产量的提高。

背景

甘薯（Ipomoea batatas）富含维生素、矿物质和膳食纤维，是最重要的粮食作物之一，在全球主食产量中排名第七（Bovell-Benjamin, 2007 , 2010）。作为一种无性繁殖的块根作物，由于病毒病害的世代相传，甘薯产量大大降低（Loebenstein et al., 2015）。CRISPR-Cas13 可能是比 RNAi 更好的策略来提高红薯的 SPVD 抗性。在这项研究中，使用本氏烟草作为模型植物比较了四种不同 Cas13 变体的 RNA 靶向活性，以验证 CRISPR-Cas13 在工程甘薯 SPVD 抗性中的应用。LwaCas13a 和 RfxCas13d 被确定为用于 RNA 病毒靶向的两种有效的 Cas13 直系同源物。此外，使用 LwaCas13a 靶向 SPCSV - RNase3 可恢复宿主细胞中 RNAi 的能力，并提高本氏烟草植物对 SPCSV-RNase3 介导的病毒协同作用的耐受性。最后，生成的RNase3-靶向 RfxCas13d 转基因甘薯植物表现出显着增强的 SPVD 抗性。这项研究可能会为红薯抗 SPVD 的遗传改良提供一种新策略。

材料与方法

1、本氏烟转基因

本氏烟草的叶盘用携带RNase3靶向 LwaCas13a 载体的根癌农杆菌GV3101感染3 天，然后转移到含有头孢噻肟 (500 mg