qPCR引物设计原则及设计实操

一、PCR引物设计原则

首先，大家在进行qPCR引物设计时，为提高引物特异性，避免非特异性扩增，需要尽量遵循以下设计原则。

 二、PCR引物设计注意事项

1、产物长度：产物一般保持在200- 300 bp。产物长度过短，可能无法区分引物二聚体与目的产物；产物长度过长，则可能由于酶活限制影响扩增效率。

2、转录本选择：若基因存在多个转录本，则需要在引物设计前明确检测目的。若需要检测所有转录本的表达水平，则需针对不同转录本共有序列进行引物设计；若需要检测特定转录本的表达水平，则需要针对该转录本特有序列进行引物设计；

3、跨内含子设计：虽然在进行反转录操作时会选择去除基因组DNA操作，但为避免残留基因组DNA干扰，在设计qPCR引物时尽量跨内含子进行设计（内含子序列越大越好），或者将引物设计在外显子结合区域。

三、qPCR引物设计方法

NCBI作为科研过程的神器之一，不仅能够用于基因序列查找和比对，同样可以进行qPCR引物设计。本期，伯小医为大家示范如何利用NCBI设计qPCR方法流程：

（1）打开NCBI网站，输入基因名称（GAPDH为例）；

（2）选择“Genes”，“gene”，并选择本研究所需物种的条目（以Human为例）；

（3）页面下拉至“mRNA and Proteins”，选择合适的转录本序列（以NM_001289745.3为例）；

（4）点击页面右侧“Analyze this sequence”，“Pick Primers”，跳转至引物设计页面；

（5）根据需求更改参数，可参考如下设置：

（6）网站进行引物设计，等待一段时间后（一般几分钟即可）便出现引物序列信息页面；

其中，Graphical view of primer pairs页面显示引物位置基本信息，鼠标单击上下游引物蓝色箭头，可显示该引物对基本信息；

Detailed primer reports为引物详细信息，对于符合扩增长度的引物，网站会给出产物长度信息，大家只需要筛选引物设计原则挑选合适引物即可；

备注：如果已知NM序列，可直接打开网站（BLAST: Basic Local Alignment Search Tool），点击“Primer Blast”，即可跳转至引物设计页面；然后在PCR Template处输入NM号或者序列信息，并进行参数设置即可；

上述内容就是关于qPCR引物设计原则和方法，相信大家看完文章内容基本都能掌握qPCR设计的基本原则，并学会如何进行PCR引物设计，预祝所有的小伙伴在进行qPCR引物设计时百发百中，每个选择的都是最好的！！！