qPCR引物设计的骚操作，你get到了吗？

最新推荐文章于 2024-09-10 16:00:52 发布

启衡星

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文章标签：深度学习

本文链接：https://blog.csdn.net/qihengxing123/article/details/135292134

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本文详细介绍了qPCR引物设计的规则，包括引物长度、G+C含量、3'端碱基选择、Tm值计算、ΔG值、引物二聚体、探针法额外注意事项等。同时，提到了RNA样本引物设计的特殊考虑，如扩增效率、可变剪切、引物生产工艺和位置选择。此外，推荐了几个常用的引物设计软件和网址，以及如何验证引物的唯一性。

摘要由CSDN通过智能技术生成

01引物设计的规则

作为PCR技术的一个分支，qPCR的引物设计同样也遵循PCR引物设计时的基本规律。同时，由于qPCR的定量方式主要分为染料法及探针法，因此在引物设计时也有所区别。SYBR染料法（StarLighter SYBR Green qPCR 预混液（通用型））在引物设计时遵循的规律与常规PCR差别不大，主要需注意以下几点：

1 . 引物长度一般在17～25碱基之间，G＋C含量在40％～60％之间；

2 . 引物3'端最后一个碱基对Taq酶（StarLighter 热启动Taq DNA 聚合酶）DNA合成效率有较大的影响，不同末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配率明显高于其他3个碱基，T次之，因此应当避免在引物3'端使用碱基A或T。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物；

3 . 引物碱基要随机分布，自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补；

4 . 引物所对应模板位置序列的Tm值在 72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在Oligo软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method）。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温度根据较低的 Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。而