DNA甲基化芯片专题

DNA甲基化是最早被发现的表观修饰之一，引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化修饰参与了多个生物学过程，包括细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、组织特异性等，与癌症、衰老、老年痴呆、糖尿病等多种复杂疾病密切相关。

DNA甲基化的检测方法包括WGBS、MeRip、RRBS、芯片技术等等。

基于芯片的甲基化图谱分析，目前包括Agilent平台、Illumina平台，Roche NimbleGen平台等。而目前研究中常见的多为Illumina Human Methylation 450K BeadChip和Infinium MethylationEPIC BeadChip（简称850k芯片）。本文对2019年5篇文献进行简述，介绍甲基化芯片在研究中的应用。

案例1：阿尔茨海默氏病脑中的增强子低甲基化为细胞死亡铺平了道路

原文：Li P, Marshall L, Oh G, et al. Epigenetic dysregulation of enhancers in neurons is associated with Alzheimer’s disease pathology and cognitive symptoms. Nat Commun. 2019;10(1):2246. Published 2019 May 21. doi:10.1038/s41467-019-10101-7

期刊：Nature Communications 影响因子：11.878

研究发现，增强子在AD中发挥了作用; 然而，这些序列的DNA甲基化结果的研究仍未走上正轨。现在，来自Viviane Labrie（美国Van Andel研究所）实验室的研究人员为增强对AD中增强子作用的理解铺平了道路。

虽然Tau蛋白的神经元内神经原纤维缠结和淀粉样前体蛋白（APP）衍生的细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块是AD的特征，但促进这些病理学发展的机制仍是一个活跃的研究领域。因此，该团队利用了亚硫酸氢盐探针测序（一种靶向的DNA甲基化测序方法）来探索增强子在AD发展过程中的作用。他们设计了59,009个探针来覆盖目前定义的29,132个脑增强子（122,071个CpG和1,085,436个CpH位点，其中H = A，C或T），然后从101个无或轻度、中度和重度AD患者的前额叶皮质样本中分离出神经核。

以下是他们的发现：

1224个差异甲基化区域主要是低甲基化（> 75％）。

最著名的转录因子基序属于ETS家族，该家族控制细胞分化，细胞周期和凋亡。

顶端从头甲基化中CpH甲基化占主导地位，特别是CpA甲基化 。

其中一个最重要的差异甲基化区域（DMR）映射到DSCAML1中的增强子，其低甲基化先于神经原纤维缠结的发生 。

整合以前发布的高通量测序的染色体构象捕获（Hi-C）数据，发现已鉴定的AD增强子与1207个基因中的1942个启动子顺式相互作用。

途径分析突出了这些基因在与神经发生、发育和脑部疾病有关的AD相关功能中的作用。

该DSCAML1增强子与附近的BACE1启动子相互作用，其编码的蛋白裂解APP和在致病Aβ斑的产生中起关键作用。

DMR与来自样本子集的RNA测序（RNA-seq）数据的整合分析，发现与细胞周期重入和淀粉样蛋白神经病有关的网状系统。

通过将RNA-seq数据与一个独立却规模更大的450KDNA甲基化阵列联合分析，研究小组独立地证实了DSCAML1增强子中单个CpG的低甲基化与早期AD中 BACE1表达改变相关，而与晚期AD无关。

DSCAML1 增强子的低甲基化也与AD病理和认知症状相关。

通过检测DSCA， ML1区域中基因表达与基因型（SNP）之间的关系，研究小组发现会影响BACE1表达的五种单倍型：基因自身中的三种和DSCAML1 增强子中的两种。

然后，该小组检测了年龄与AD之间的联系，他们观察到CpH甲基化程度随年龄增加而下降，该年龄趋势在AD晚期达到平稳。

他们还发现，晚期AD患者通过应用特定的表观遗传时钟，表现出加速的表观遗传衰老。

最终，该团队提出了一个基于CpH甲基化的假设模型。在早期神经发育过程中，CpH甲基化积累并触发从增殖和迁移到突触形成和消减的转变。但是，尽管CpH甲基化作用在生命后期降低，但该过程在AD中被加速，并在分化的有丝分裂后神经元中重新激活细胞周期，触发凋亡，而不是促进增殖。

高级作者 Viviane Labrie表示：“在成年人中，脑细胞通常会分裂。当增强子重新激活细胞分裂时，会造成难以置信的损害。他们发现增强子的变化也促进了斑块的发展，在大脑中快速传播。综合来看，促进斑块、缠结和细胞周期再激活的增强子异常似乎为阿尔茨海默氏病的脑细胞死亡铺平了道路。”

案例2：DNMT3A突变引起的过度生长综合征

原文：Jeffries AR, Maroofian R, Salter CG, Growth disrupting mutations in epigenetic regulatory molecules are associated with abnormalities of epigenetic aging. Genome Res. 2019 Jul;29(7):1057-1066. doi: 10.1101/gr.243584.118. Epub 2019 Jun 3.

期刊：Genome Research 影响因子：9.944

作为DNA甲基转移酶，突变的DNMT3A可能会导致致病性过度生长，称为Tatton-Brown-Rahman综合征（TBRS）。尽管人们已经知道DNMT3A在TBRS（种系突变）和血液癌（体细胞突变）中的作用，但对DNMT3A突变体对甲基化组的作用了解甚少。值得庆幸的是，由埃克塞特大学医学院（英国埃克塞特）的乔纳森·米尔（Jonathan Mill），安德鲁·克罗斯比（Andrew Crosby）和艾玛·巴普尔（Emma Baple）领导的一组高性能研究人员新发表了研究，以解决这个问题。

该团队通过检测一个庞大的阿米什家庭开始了他们的研究，其中包括四名DNMT3A Arg771Gln突变的TBRS患者。他们使用Illumina 450k甲基化芯片，通过将TBRS家族成员与未受影响的兄弟姐妹进行比较，寻找DNA CpG甲基化的特异性位点的差异。然后，他们扩大了分析范围，以包括更多的TBRS患者和其他DNA甲基转移酶疾病。

他们发现了以下结果：

患有TBRS的人表现出与生长、发育和分化相关的基因广泛的甲基化不足。

所有检测的DNMT3A突变体都观察到了这一点。

TBRS个体加速了表观遗传衰老。

在DNMT3A Arg771Gln携带者的Amish家族中，表观遗传年龄比实际年龄大40%。

表观遗传年龄约比实际年龄明显增加800％，这发生在种系DNMT3A突变体Arg882Cys的患者中，这是与急性髓细胞性白血病（AML）相关的常见体细胞突变。

其他两种组蛋白甲基转移酶疾病，Sotos综合征（过度生长）和Kabuki综合征（生长障碍）分别增加或减少了表观遗传衰老。

总体而言，作者假设DNMT3A功能降低和由此导致的TBRS患者甲基化不足可能潜在地促进了祖细胞增殖的增加和分化的降低，从而导致了过度生长综合征的表型。

案例3：血液白细胞 DNA 甲基化预测未来心肌梗死和冠心病的风险

原文：Agha G, Mendelson M M, Ward-Caviness C K, et al. Blood Leukocyte DNA Methylation Predicts Risk of Future Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease: A Longitudinal Study of 11 461 Participants From Population-Based Cohorts[J]. Circulation, 2019, 140(8): 645-657.

期刊：Circulation 影响因子：23.054

体外研究和动物研究证明，冠心病（CHD）的发展涉及白细胞DNA甲基化的改变。DNA甲基化和CHD在人类先前的研究一般都是小样本研究（例如，n <300），集中在重复元件或选择性的基因组区域，横断面或设计的病例-对照中。血液白细胞DNA甲基化是否可预测未来冠心病尚未得到全面研究。CHARGE联盟成员对多个预期队列中与冠心病相关的血液DNA甲基化进行了研究。

他们使用Illumina Infinium 450k芯片对表观基因组范围的全血白细胞DNA甲基化进行了分析，包括来自美国和欧洲的11项人群队列研究，总共11 461名参与者。首先，评估11 461名参与者白细胞DNA甲基化是否与冠心病风险相关；然后，将已鉴定的CHD相关甲基化位点的信息与遗传序列变异相结合，以提供反映CHD风险的完整基因组图谱，并评估是否有证据表明DNA甲基化变异与入射CHD有因果关系。

以下是他们的结果：

无冠心病的11 461名患者（平均年龄64岁，女性67％，非裔美国人35％）中，有1895名患者在平均2年的随访中发展为冠心病。

52 个CpG位点的甲基化水平与冠心病或心肌梗死有关。在52个CpG中，有11个在DNA甲基化与CHD的关联中显示了种族特异性差异（t统计量差异P <0.05）。

对于52个与CHD相关的CpG中的10个，他们能够检测和复制每个CpG的多个meQTL，总共包括1634个唯一的SNP。

一些差异甲基化的基因座映射到与钙调节和肾功能有关的基因。

这些CpG映射到在钙调节中具有关键作用的基因（ATP2B2，CASR，GUCA1B，HPCAL1），以及在全基因组和表观基因组研究中被确定与血清钙（CASR），血清钙相关的冠心病风险（CASR），冠状动脉钙化斑块（PTPRN2）和肾功能（CDH23，HPCAL1）等相关的基因。

用孟德尔随机化法鉴定DNA甲基化与冠心病发病的因果关系。

cg26470101 和cg07289306 这2个位点处的甲基化可能通过非编码RNA调节和组织结构元件影响CHD的发展。

两种CpG都映射到CpG岛内的活性基因调控区域，并且cg07289306位于2个长的非编码RNA（lncRNA）转录本近端。

他们的发现提供了第一个证据，表明通过肾功能和钙稳态相关途径的表观遗传修饰进行基因组调控可能与冠心病的发生有关。非编码RNA相关的表观遗传位点的发现突显了CHD的全基因组研究中尚未出现的途径，并且可能代表了迄今为止尚未探索的新型治疗靶标。

案例4：延胡索酸靶向多发性硬化症中脑归巢T细胞的代谢表观遗传相互作用

原文：Achilles Ntranos, Vasilis Ntranos, Valentina Bonnefil, Jia Liu, Seunghee Kim-Schulze, Ye He, Yunjiao Zhu, Rachel Brandstadter, Corey T Watson, Andrew J Sharp, Ilana Katz Sand, Patrizia Casaccia, Fumarates target the metabolic-epigenetic interplay of brain-homing T cells in multiple sclerosis, Brain, Volume 142, Issue 3, March 2019, Pages 647–661

期刊：Brain 影响因子：11.814

在延胡索酸-水合酶缺陷型癌细胞中进行的研究表明，延胡索酸的细胞内积累可通过抑制α-酮戊二酸依赖性双加氧酶和TET酶来引起DNA超甲基化。DNA去甲基化对于T细胞谱系测定，幼稚T细胞活化和记忆T细胞形成很重要。此外，TET介导的活性DNA去甲基化是调节CD4 T细胞功能的重要表观遗传机制。幼稚的CD4 T细胞与记忆性CD4 T细胞相比甲基化程度更高， DNA主动去甲基可以被视为免疫调节靶标。因此，他们研究了延胡索酸（FAEs）的外源给药是否可调节多发性硬化患者T细胞中的DNA甲基化并解释观察到的免疫调节作用。

他们招募了47名未接受治疗和35名以延胡索酸治疗的多发性硬化患者，以及16名醋酸格拉替雷治疗的患者作为非代谢药物治疗的对照。

结果如下：

延胡索酸对多发性硬化症患者CD4和CD8 T细胞中大脑归巢趋化因子受体CCR6表达有着显著的免疫调节作用，其中包括辅助性T17细胞和细胞毒性T17细胞。

FAEs治疗最突出的免疫调节作用是CCR6 + CD4和CD8 T细胞减少。

使用Illumina EPIC 850K BeadChip在未经治疗和已治疗的多发性硬化症患者中分离出CD4 T细胞DNA甲基化的差异。

与氨基酸聚合物（例如醋酸格拉替雷）相比，三羧酸循环中间产物（例如延胡索酸）对CD4 T细胞中表观基因组范围的DNA甲基化变化明显具有更高的影响。

FAEs治疗可使多发性硬化症患者CD4 T细胞中的MIR-21基因位点甲基化，Th17细胞中MIR-21基因座显著超甲基化。

用延胡索酸体外处理CD4和CD8 T细胞支持MIR-21启动子对DNA甲基化具有特异性且剂量依赖性的作用。

如果在体外用延胡索酸处理在辅助性T17细胞或细胞毒性T17细胞极化条件下刺激的CD4或CD8 T细胞，则可以抑制miR-21转录和CCR6表达的上调。

这些数据共同定义了延胡索酸治疗与CD4和CD8 T细胞中MIR-21基因座超甲基化之间的直接联系，并表明延胡索酸在多发性硬化症中的免疫调节作用至少部分归因于表观遗传调控归巢的CCR6 + CD4和CD8 T细胞。

据此，他们提出了一种多发性硬化症中免疫调节的新机制，该机制利用了大脑归巢的CCR6 + CD4和CD8 T细胞中的代谢表观遗传相互作用，并将FAEs与其他可用的多发性硬化症疗法区分开来。

案例5：DNA甲基化调节的QPCT通过增加肾细胞癌的HRAS稳定性来促进舒尼替尼耐药

原文：Zhao T, Bao Y, Gan X, et al. DNA methylation-regulated QPCT promotes sunitinib resistance by increasing HRAS stability in renal cell carcinoma. Theranostics. 2019;9(21):6175–6190.

期刊：Theranostics 影响因子：8.063

已知舒尼替尼可提高晚期肾细胞癌（RCC）患者的生存率，但药物的不良反应（如耐药性）导致舒尼替尼无法有效延长RCC患者的生存期。研究发现，在几个基因中的DNA甲基化，如RASSF1A变化、VHL、和EZH2与RCC有关，且DNA甲基化的变化可调节这些基因的表达，最终导致RCC发展。然而，仍然缺乏关于DNA甲基化在RCC中对舒尼替尼耐药性的作用的研究。

对此，他们进行了相关研究。使用Illumina HumanMethylation 850K芯片，在舒尼替尼无反应和有反应的RCC组织之间发现了具有差异的甲基化CpG位点，并通过Sequenom MassARRAY甲基化分析验证甲基化芯片的结果。通过qRT-PCR，蛋白印迹和免疫组化实验验证了在舒尼替尼无反应和有反应的RCC组织中的谷氨酰胺肽环转移酶（QPCT）表达。然后，使用细胞计数试剂盒8（CCK-8），平板菌落形成试验和流式细胞术测定法来验证QPCT干预或过表达后QPCT在RCC舒尼替尼耐药中的功能。进行了染色质免疫沉淀（ChIP），以阐明QPCT的上游调节机制。使用人类蛋白质组微阵列测定法来鉴定与QPCT相互作用的下游蛋白质。

结果如下：

在舒尼替尼无反应和有反应的RCC组织之间， QPCT启动子区域的甲基化程度显着不同。

在舒尼替尼无反应的RCC组织中，QPCT启动子区域的甲基化程度显着降低，并且QPCT的表达上调，这与临床上对舒尼替尼的不良反应有关。

QPCT的下调促进RCC细胞对舒尼替尼的敏感性，而QPCT的过表达可在体内外促进RCC细胞对舒尼替尼的耐药性。

通过RCC细胞中的5-氮杂-2’-脱氧胞苷（地西他滨）降低QPCT启动子区域的甲基化水平可以增加QPCT和与QPCT启动子区域结合的NF-κB（p65）的表达，从而积极调节其表达，而QPCT启动子区域的高甲基化可以抑制NF-κB（p65）的结合。

QPCT可以与HRAS结合并减弱HRAS的泛素化降解，从而增加其稳定性。HRAS通过促进RCC细胞中ERK磷酸化在QPCT介导的舒尼替尼耐药中发挥作用。

HRAS在RCC的舒尼替尼无反应组织中上调，HRAS的过度表达可促进肾癌细胞对舒尼替尼的耐药。

而lonafarnib对HRAS的抑制可恢复RCC细胞对舒尼替尼的敏感性。

结论：受DNA甲基化和NF-κB（p65）调控的QPCT通过减少HRAS的泛素化来促进舒尼替尼耐药，从而激活RCC中的ERK途径。QPCT可能是RCC患者对舒尼替尼治疗反应的新预测指标，并可能成为治疗目标。