易基因 | 学科前沿：靶向甲基化测序揭示维生素C可防止孕期吸烟引发的后代DNA甲基化改变

易点评：

母亲在怀孕期间吸烟会导致婴儿可能出现终身性的肺功能下降。为了确定维生素C是否能够减少母亲吸烟所引起的后代甲基化变化，以及特定CpG的甲基化是否与呼吸系统疾病有关。作者在一项代号为NCT00632476的临床试验中采集胎盘、脐带血和口腔上皮样本进行靶基因重亚硫酸盐测序（Targeted bisulfite sequencing，TBS），然后使用重亚硫酸盐扩增子测序（bisulfite amplicon sequencing，BSAS）对选定的脐带血差异甲基化区域（DMR）进行独立验证分析。分析结果发现实验组和对照组间的甲基化差异≥10% 的绝大多数CpG(69.03%)在接受维生素C处理后可以恢复到非吸烟者水平(至少50%)。

研究背景：

在大力反对吸烟的大环境下，孕期吸烟的比率仍旧高的惊人，大约50%的吸烟者在怀孕后将继续吸烟。据估计，在美国出生的婴儿中，至少有12%由于母亲吸烟在产前就暴露于二手烟中。在子宫内接触烟草烟雾是导致新生儿出生体重低、早产和婴儿死亡的最大可预防原因之一，并与终身肺功能下降和儿童哮喘风险增加有关。因此，了解母亲吸烟对胎儿肺功能发育的影响机制并找出预防措施是至关重要的。

表观遗传可能与母亲吸烟对胎儿呼吸功能产生终身的影响有关。表观遗传在疾病的发生发展中扮演着至关重要的角色，孕妇在怀孕期间吸烟显然与发育中的胎儿、脐带血和胎盘组织特异性以及DNA甲基化模式有关。血液和口腔上皮组织甲基化分析表明，一些甲基化位点的改变会从婴儿期一直持续到儿童甚至青春期。此外，母亲吸烟会导致特定位点的甲基化改变从而产生影响功能的后果，例如早产、胎儿生长减缓和哮喘风险大大增加。

维生素C(抗坏血酸)是一种必需维生素，不能在人体内合成，需要人们通过膳食或营养补充剂摄取。吸烟已被证实会显著降低血液中维生素C的水平，孕妇吸烟者维生素C的缺乏会延伸到发育中的胎儿。除了众所周知的抗氧化功能外，维生素C还作为许多单加氧酶和双加氧酶的必需辅因子，包括TET酶家族，它在DNA脱甲基化的过程中催化5mC到5hmC的羟基化。

  在一项随机、双盲临床试验(NCT00632476)中发现，给那些在怀孕期间不戒烟的女性每天补充500毫克维生素C (从怀孕的第22周开始)，会改善新生儿的肺功能，降低一岁以下哮喘的发生率。作者试图确认在该试验儿童的胎盘、脐带血或口腔上皮样本中与母亲吸烟相关的DNA甲基化水平是否会通过补充维生素C而得到恢复。

研究结果：

NCT00632476试验的患者特征以及有关肺功能和哮喘的数据已于先前发表。作者在每个组织中检测了超过70,000个CpG(胎盘=79,258；脐带血=81,461；口腔上皮=71,955)。协变量分析发现原始甲基化特征与性别和文库批次显著相关，因此作者将批次效应和性别纳入了统计模型。

作者在每个组织中分别检测到3,000多个甲基化的CpG(p值<=0.05；胎盘=3,112 CpG，脐带血=4,527 CpG，口腔上皮=3,378 CpG)。与已有研究一致，实验组和对照组的后代之间DNA甲基化有显著性差异(p≤0.05；胎盘=1,297 CpG；脐带血=2,337 CpG；口腔上皮=1,572 CpG)。对差异甲基化的CpG进行无监督等级聚类结果显示，补充维生素C的吸烟者所生患者与非吸烟者的三种组织中的甲基化更相似(图1)。值得注意的是，通过维生素C补充后至少恢复了吸烟组和不吸烟组差异的50%(图2)。

去除受性别影响的CpG以及对p值进行FDR调整后，作者在三个组织中共确定了203个恢复的CpG。在脐带血中，有118个恢复的CpG(72个低甲基化，46个高甲基化)映射到99个特异性位点。功能注释分析涉及神经、胎盘发育、癌症、肿瘤、染色体重排以及谷胱甘肽代谢等功能。在口腔上皮中，有84个恢复的CpG(60个低甲基化，24个高甲基化)定位到76个特异性位点，主要功能涉及信号、糖蛋白以及癌症相关。

 

TBS测序的一个优点是可以在特定区域产生大量单一CpG信息，从而能够识别连续CpG上的差异甲基化区域(DMR)，这可能比单个CpG上的甲基化信息更有生物学意义。因此，作者使用comb-p来识别非吸烟者和使用安慰剂治疗的吸烟者之间的DMR(简称NP DMR)，以及接受安慰剂和维生素C治疗的吸烟者之间的DMR(简称PV DMR)。

与母亲吸烟最显著相关的10个DMR(NP DMR)和每个组织中恢复最显著的10个DMR(PV DMR)在文后表中列出。在脐带血中，作者确定了43个显著恢复的DMR，其中最大的位于RUNX1(因母亲吸烟而低甲基化的6个CPG因使用维生素C得以恢复)(图3A)。在胎盘中，作者鉴定出64例NP DMR和108例PV DMR，其中有20个DMR重叠，19个通过补充维生素C至少恢复了50%。胎盘组织中最显著恢复的DMR定位于HIVEP3启动子内(通过comb-p调整FDR后有12个CpG差异显著。最后，在口腔上皮中，补充维生素C组与安慰剂组相比，111个与母亲吸烟相关的DMR中有32个显著恢复。在口腔上皮组织中SLC18A3的DMR包含由于维生素C的使用而恢复的最多的CpG。

 

 作者使用替代方法重亚硫酸盐扩增子测序(BSAS)对14个脐带血DMR进行了验证。BSAS对所有321个CpG的测序覆盖深度中位数为337x。在14个DMR(12个基因)中，作者获得了24名患者和191个CpG的TBS和BSAS数据。相关分析显示TBS和BSAS甲基化在患者间有很强的一致性。95.7% CpG的TBS和BSAS甲基化差异在平均值标准差在1.96以内，这表明两种方法具有很强的一致性，没有系统性偏差。这两种方法都发现了母体吸烟引起了BMP4和COL5A1的高甲基化，以及PRDM8、RUNX1、NOS3、SLC18A3、ChAT和HOXA7的低甲基化。在这两个数据集中，维生素C的使用显著逆转了PRDM8(图4)和RUNX1(图3A)的低甲基化。

作者还通过一项最近发表的关于母亲吸烟对新生儿脐带血影响的Meta分析中检验了其研究结果正确性。对13个队列进行的Meta分析发现，超过6000个CpG与母亲吸烟有关，其中包括2965个CpG基因座，在此之前还没有任何一项达到统计学意义的单独研究。在Meta分析中，作者对脐带血的靶向分析覆盖了6073个符合FDR的CPG中的323个。在这323个CpG中，35个位于作者研究中确定的24个特异性DMR，这35个中有26个CpG遵循Meta数据以及作者的研究结果：GFI1中6个CPG低甲基化(图3B)，AHRR中5个低甲基化(图3C，1个低甲基化和4个高甲基化)，PRDM8中5个低甲基化(图4)，BMP4(图3D)和ADORA2B中2个高甲基化，以及2个低甲基化。Meta分析显示，持续吸烟与非吸烟者和安慰剂组间新生儿甲基化差异情况显著相关(p=0.0002)。Meta分析发现脐带血中母亲吸烟有显著关联而在上述DMR中差异不显著的单个CpG中，补充维生素C的CpG与RUNX3、KLHL29、RARB、PRDM8、AHRR、CNTNAP2和FERMT3的甲基化有部分或完全逆转。

最后，作者分析了维生素C补充后恢复的因母亲吸烟引起甲基化改变的特定位点是否与呼吸系统疾病的发生有关。在所有3个组织中，作者观察到与出生时肺功能相关的得到恢复的CpG显著富集。作者还发现，哮喘患儿脐带血中低甲基化的CpG显著富集，而补充维生素C后会逆转这一现象。值得注意的是，作者在AHRR、RXRA、PRDM8、DLGAP2和TBC1D16中发现了3个或多于3个CpG在母亲吸烟的样本中表现出低甲基化，在哮喘患儿中表现低甲基化，但在接受维生素C补充后其甲基化得到恢复。

研究结论：

作者发现了一种在维生素C诱导下的跨多个位点的DNA甲基化模式。这种模式在组织和时间上的一致性表明了对后代DNA甲基化的系统性和持续性影响。有必要继续进行研究，以确定全基因组DNA甲基化变化如何反映母亲吸烟对后代肺功能的影响。

关于靶基因DNA甲基化测序

亚硫酸盐靶基因扩增高通量测序是针对已有目标基因panel组合，运用自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化或氧化亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化和/或羟甲基化精准检测。

技术优势：

➢ 超高深度亚硫酸盐甲基化测序，检测准确性极高，完胜传统BSP测序；

➢ 实现近百个基因的多重扩增，检测通量高，优于焦磷酸甲基化测序；

➢ 检测灵敏度高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；

➢ 平行化学氧化后亚硫酸盐测序，甲基化和羟甲基化精准检测；

➢ 样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；

➢ 适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；

➢ 检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。

原文解读：

学科前沿 | 靶向甲基化测序揭示维生素C可防止孕期吸烟引发的后代DNA甲基化改变https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwNTY3NDIxMw==&mid=2650648933&idx=1&sn=c50b9a98431cd69da6f04386512b4525&chksm=831014efb4679df985b3f514de9bf561dcd329e17c7e487e3dccd7935c7a7411e5da04bc1d3c&token=276961837&lang=zh_CN#rd