易基因｜典型案例：MeRIP-seq综合分析肺腺癌中的转录组m6A甲基化组

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2022年8月11日，南方科技大学王玉琨教授团队以“Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing”为题在《Frontiers in Oncology》杂志上发表研究论文，通过MeRIP-seq和对应的转录组测序（RNA-seq）联合分析验证了m6A甲基化修饰与肺腺癌（LUAD）进展之间的强关联。

标题：Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing（通过MeRIP-seq全面分析肺腺癌转录组范围的m6A甲基化组）

时间：2022.08.11

期刊：Frontiers in Oncology

影响因子：IF 5.738

技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、mRNA-seq

样本：3个肺腺癌（LUAD）样本和3个癌旁正常组织样本，共6个样本

实验：MeRIP-seq、mRNA-seq、甲基化组与转录组关联分析、结合公共数据库分析、实验验证（qPCR、RIP-qPCR）

摘要：

N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA上最丰富的修饰。越来越多的证据表明m6A在肿瘤进展中起关键作用，因此分析肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）转录组范围内的m6A修饰非常重要。本研究采集三对LUAD组织样本和癌旁正常组织样本，利用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）来鉴定肿瘤和癌旁正常组织之间的差异m6A修饰。共鉴定出4041个异常m6A peaks，其中1192个m6A peaks上调，2849个m6A peaks下调，失调的m6A peak基因在癌症、Rap1信号通路和胰岛素抵抗通路中富集。

对MeRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析，鉴定出612个m6A peaks和RNA表达异常调控基因。KEGG分析鉴定出612个基因在癌症相关信号通路中富集，包括cGMP-PKG信号通路和Rap1信号通路。GSEA富集分析表明，这些基因在细胞周期相变、细胞分裂、细胞对DNA损伤刺激响应和染色体组织中富集。

为进一步研究差异m6A修饰基因与LUAD患者临床参数之间的关系，作者搜索了癌症基因组图谱（TCGA）并鉴定了2个与LUAD患者预后和诊断相关的基因——FCRL5和GPRIN1。同时，在GEPIA2数据库中发现GPRIN1和m6A reader YTHDF1之间呈正相关，证明了YTHDF1与GPRIN1 mRNA结合并调控其表达。本研究结果表明，m6A修饰在LUAD的进展和预后中起重要作用，可能是未来LUAD患者潜在的新治疗靶点。

结果图形

（1）LUAD 中的 m6A 甲基化图概述

图1：LUAD中m6A甲基化特征

1. 排名前三的m6A motif。
2. m6A peak在正常和肿瘤组织中的分布图。

(C, D) 差异m6A peak的分布图。

(E)直方图显示正常和肿瘤样本之间 m6A 富集的变化。(F)显著差异m6A peak 火山图。

(G)每个 mRNA 变化的 GGAC 序列的分布。

(H)差异 m6A peak在染色体上的分布。

表1：LUAD组织与正常组织的前20个m6A甲基化peaks

（2）含有m6A基因参与重要的生物学过程和通路

图2：差异 m6A 基因的 GO 功能富集和 KEGG 通路富集

1. 下调m6A peak基因的前 10 GO类别图。
2. 上调m6A peak基因的前 10 GO类别图。
3. 下调m6A peak基因的前 10 KEGG 通路图。
4. 上调m6A peak基因的前 10 KEGG 通路图。

图3：肿瘤和正常组织之间的差异甲基化基因GO富集分析

（3）转录组图谱及MeRIP-seq与RNA-seq数据的联合分析

图4：MeRIP-seq与RNA-seq数据的联合分析

1. 差异表达基因火山图。
2. 差异表达基因热图。
3. 四象限图显示了 m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化的基因分布。
4. m6A 修饰和 mRNA 水平均发生显著变化基因的前 10 GO 类别图。
5. m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化基因的前10 KEGG通路 图。

(F、G、H、I）m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化基因的GSEA富集图。

表2：肿瘤组和正常组m6A-seq&RNA-seq的前20个差异基因

（4）鉴定含有m6A修饰的2个基因与LUAD患者的临床参数相关

图5：m6A修饰调控的基因表达与TCGA数据库中临床参数的关系

1. 本研究中的基因与 TCGA 数据库的交集。
2. 前20 个基因的单变量 Cox 回归分析。

（C、D）分别为 GPRIN1 和 FCRL5 的总体生存曲线。(E) GPRIN1 表达与 N 的关系。

(F, G, H) FCRL5 表达与 M、N 和临床分期的关系。

(I, J) GPRIN1 和 FCRL5 的ROC曲线（N：淋巴结转移；M：远处转移。）

表3：肿瘤组和正常组中m6A-seq＆RNA-seq＆TCGA）的前20个差异基因

图6：m6A reader YTHDF1 调控 GPRIN1 表达

1. GEPIA2 数据库中 YTHDF1 和 GPRIN1 之间存在强正相关。

（B，C）分别在 CPTAC 数据库中 YTHDF1 和 GPRIN1 的蛋白质表达。

(D) GPRIN1 的m6A peak分布。

(E) YTHDF1 的敲低下调了 LUAD A549 细胞中 GPRIN1 的 RNA 水平。

(F)通过 RT-qPCR 测量 A549 细胞中 RIP 衍生的 RNA。

结论：

本研究利用MeRIP-seq和mRNA-seq技术，证明了 m6A 修饰与 LUAD 进展之间强关联。筛选出了2个与LUAD患者的预后和诊断相关的基因（FCRL5和GPRIN1）。此外，还发现 GPRIN1 作为 YTHDF1 的下游目标。

关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术

易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。

大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。

易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：

• m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
• m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
• m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
• 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）

技术优势：

• 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
• 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
• 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
• 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
• 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。

研究方向：

m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究

• 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
• 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
• 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式

关于m6A甲基化研究思路

（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析

（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示

（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略

（4）进一步验证或后期试验

易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

参考文献：

Mao W, Yu Q, Wang K, Ma Q, Zheng Y, Zhang G, Luo W, Wang N, Wang Y. Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing. Front Oncol. 2022;12:791332.

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