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食管癌是一种常见的恶性肿瘤，包括两种主要的组织学亚型：食管鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（adenocarcinoma，EAC）。近两年来对抗肿瘤免疫应答机制的理解得到了显著提高，免疫检查点阻断 （ICB） 疗法等免疫疗法改变了包括 EAC 在内的许多癌症的临床管理范式。然而EAC中对免疫细胞瘤内转运调控分子机制知之甚少。
美国南加州大学De-Chen Lin和Uttam K Sinha团队利用包括WGBS、ChIP-seq、RNA-seq和功能性实验在内的多种方法，对食管腺癌（EAC）进行表观基因组学等分析，揭示了转录因子FOXM1是EAC中抗肿瘤免疫应答的关键调控因子。相关研究成果于2024年2月19日，以“Epigenomic analyses identify FOXM1 as a key regulator of anti-tumor immune response in esophageal adenocarcinoma”为题发表在《cell death & disease》期刊上。
标题：Epigenomic analyses identify FOXM1 as a key regulator of anti-tumor immune response in esophageal adenocarcinoma（表观基因组学分析确定 FOXM1 是食管腺癌抗肿瘤免疫应答的关键调控因子）
时间：2024-2-19
期刊：cell death and disease
影响因子：9 / Q1
技术平台：ChIP-seq、WGBS、RNA-seq等
研究摘要：
本研究利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）揭示了转录因子（TF）FOXM1是EAC的重要表观遗传学调控因子。FOXM1在EAC患者来源的类器官和细胞系模型中的细胞增殖和肿瘤生长中起着关键作用。研究人员鉴定出ERBB2是FOXM1表达和转录活性的上游调控因子。基因集富集分析（GSEA）无偏筛选揭示了FOXM1和免疫应答通路之间的显著负相关性。而同基因小鼠模型显示FOXM1抑制CD8+ T细胞的肿瘤微环境浸润，并在体外抑制CD8+ T细胞的趋化性和抗原依赖性CD8+ T淋巴细胞的杀伤活性。本研究将FOXM1鉴定为一种显著的EAC促进因子，并阐明其在调控抗肿瘤免疫应答中的新功能。
研究结果：
（1）DNA甲基化组测序将FOXM1鉴定为EAC中的重要转录因子（TF）
图1：DNA甲基化组测序将FOXM1鉴定为EAC中的重要TF。
- 分析设计的示意图。
- 候选EAC特异性转录因子(TFs)散点图。X轴表示使用TCGA RNA-seq数据的EAC与非恶性食管样本之间的表达倍数变化。Y轴显示每个TF的推断靶基因表达的基因集富集分析(GSEA)归一化富集分数(NES)。
- ETV4、HNF4A和FOXM1预测靶基因表达的代表性GSEA线图。
- FOXM1和H3K27ac peaks区域的ChIP-seq信号热图，以及匹配的WGBS信号(peak值中心±1.5 Kb)。
- 指定患者队列中FOXM1表达水平的箱线图。
- TCGA数据的高FOXM1(>平均值)和低FOXM1表达(<平均值)的EAC患者Kaplan-Meier曲线图。
（2）FOXM1 促进 EAC 的恶性表型
图 2: FOXM1促进食管腺癌(EAC)的恶性表型。
- EAC患者来源的类器官中通过siRNAs敲低FOXM1后FOXM1 mRNA的相对表达。
- 通过WST-1实验确定的细胞活性。
- Ki67免疫荧光染色。
- 经siNC或siFOXM1处理的代表性类器官的明场图像。
- 通过分析＞50个类器官来确定平均类器官大小。
F–H. EAC细胞中细胞增殖实验，其中F通过siRNA、G通过shRNAs敲低FOXM1，H通过多西环素诱导的CRISPR编辑FOXM1-knockout。
I-J. EAC细胞系的集落形成实验，其中I通过siRNA、J通过shRNAs敲低FOXM1。
K. 小鼠的解剖肿瘤异种移植物图像。每种情况下总共有6只小鼠，在两个后侧注射。
L. 肿瘤大小增长线图。
（3）ERBB2 信号转导调调控EAC 中 的FOXM1 表达和活性
图3: ERBB2信号通路调节食管腺癌(EAC)中FOXM1的表达和活性。
- ESO26细胞用1 μM Afatinib处理24小时后，通过RNA-seq测序分析FOXM1的相对表达。
- FOXM1敲低的ESO26细胞中下调基因与3种EAC细胞系（ESO26、SKGT4、OE33）共有FOXM1 ChIP-seq峰值的49个基因的交集韦恩图。
C-D. GSEA线图（C）和热图(D)显示OE19细胞敲低ERBB2后，49个基因（FOXM1特征）在RNA-seq中的表达变化。
E. 线图显示OE19细胞敲低ERBB2后，FOXM1特征基因的启动子区域归一化ATAC-Seq信号。
F. 指定样本中FOXM1 ChIP-Seq和ATAC-Seq的IGV图。
G. 有或没有ERBB2扩增的EAC患者中，49个基因（FOXM1特征）表达箱形图。
H. 条形图显示在用1 μM Lapatinib处理24小时后，FOXM1及其特征基因的相对表达。
- 三个ERBB2扩增的EAC细胞系用1 μM Lapatinib处理24小时后的FOXM1的western blot分析。
J. OE19细胞通过ChIP-qPCR分析检测FOXM1在CDKN3、CCNF和PTTG1启动子上的结合。
（4）FOXM1 抑制 EAC 中的免疫应答通路
图 4: FOXM1在食管腺癌(EAC)中抑制免疫应答通路。
A-B. 火山图展示通过siRNA沉默FOXM1的ESO26细胞（A）或TCGA的FOXM1低表达EAC样本（B）中基因集富集分析(GSEA)的结果。
C. 异种移植实验的工作流程示意图。
D. 流式细胞术分析不同肿瘤内免疫细胞群体的点图。
E. 点图展示在FOXM1低表达（底部50%）与FOXM1高表达（顶部50%）的EAC肿瘤样本中推断出的CD8+ T细胞丰度。
（5）FOXM1调控Th1趋化因子表达
图 5: FOXM1调控Th1趋化因子的表达。
A-E. 热图显示经FOXM1 siRNA转染的EAC（A）和YTN（B）细胞、或经1 μM Lapatinib处理24小时的ERBB2扩增的EAC细胞（C）、或稳定FOXM1敲低的EAC（D）和YTN（E）细胞中，特定免疫因子基因的相对表达。
F-G. 热图显示经1 μM Afatinib处理24小时(F)或ERBB2敲低(G)的EAC细胞中指定免疫基因的相对表达。RNA-seq未检测到ESO26细胞中CCL2、CCL5和TNFRSF9的表达，也未检测到OE19细胞中CCL2、CCL5和CXCL10的表达。
H-J. 条形图显示经IFNγ刺激的YTN5和YTN16细胞在有或没有FOXM1敲低的情况下，培养介质中分泌的CCL2(H)、CXCL9(I)和CXCL10(J)的蛋白量。
（6）FOXM1调控CD8+ T细胞的招募和对肿瘤细胞的杀伤活性
图6：CD8+ T细胞迁移实验和体外共培养实验的流程及结果
- CD8+ T细胞迁移实验的工作流程。
- 使用YTN5或YTN16细胞培养基迁移的CD8+ T细胞的相对数量条形图。
- 体外CD8+ T细胞共培养实验的工作流程。
- 与CD8+ T细胞共培养的YTN5和YTN16细胞的相对细胞存活率条形图。
- CD8+ T细胞对YTN5和YTN16细胞的细胞毒性杀伤活性条形图。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
应用方向：
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位
- 转录因子和辅因子结合作用
- 复制因子和 DNA 修复蛋白
- 组蛋白修饰和变异组蛋白
技术优势：
- 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
- 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
- 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
技术路线：
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.
参考文献：
Ziman B, Yang Q, Zheng Y, Sheth M, Nam C, Zhao H, Zhang L, Hu B, Bhowmick NA, Sinha UK, Lin DC. Epigenomic analyses identify FOXM1 as a key regulator of anti-tumor immune response in esophageal adenocarcinoma. Cell Death Dis. 2024 Feb 19;15(2):152. pii: 10.1038/s41419-024-06488-x. doi: 10.1038/s41419-024-06488-x. PubMed PMID: 38373993.
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