GEO数据库原始数据处理GSE149507_RAW.tar

Peanut_1123

已于 2023-10-30 08:23:26 修改

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文章标签： r语言

于 2022-09-03 13:08:11 首次发布

本文链接：https://blog.csdn.net/Laurus_Wang/article/details/126666176

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下载四个为例：存放到工作路径中

library(GEOquery)
library(dplyr)
library(tidyverse)
library(affy)
data <- ReadAffy()#读取得到S4对象

第一步：质量控制（直接观察，平均值方法，数据拟合方法分别由image函数，simpleaffy包，affyPLM包实现）
1、直接观察：图像特别黑，说明型号的强度低，图像特别亮，说明信号强度可能过饱和。（在灰度图中不要出现大面积的黑色或白色即可）
# 查看第一张芯片的灰度图像
image(data[,1])
data[,1]

2、simpleaffy包获取质量分析报告，但这个包好像是基于3.0.0以下版本的R软件，所以没有实现。
第一列为所有样本的名称
第二列为检出率和平均背景噪声
第三列蓝色为实现尺度尺子，取值（-3，3），圆形不能超过1.25，否则数据质量不好，三角形不能超过3，否则数据质量不好
bioB说明芯片检测质量没有达标

3、affyPLM包
根据计算结果画权重图，残差图和残差符号图。同样，不要出现大面积异类颜色即可。
library(affyPLM)
Pset <- fitPLM(data)
#### 根据计算结果，画权重图
image(Pset, type="weights", which=1, main="Weights")

####根据计算结果，画残差图
image(Pset, type="resids", which=1, main="Residuals")

####根据计算结果，画残差符号图
image(Pset, type="sign.resids", which=1, main="Residuals.sign")

4、查看总体质量：
一个样本所有探针组的相对对数表达（RLE）分布和相对标准差（NUSE）箱线图表示。
library(affyPLM)
library(RColorBrewer)
# 对数据集做回归计算
Psel<-fitPLM(data)
# 载入一组颜色
colors<-brewer.pal(4,"Set3")
# 绘制RLE箱线图
Mbox(Pset, ylim=c(-1,1),col=colors,main="RLE",las=3)

##绘制NUSE箱线图
boxplot(Pset,ylim=c(0.95,1.05),col=colors,main="NUSE",las=3)

5、查看RNA降解曲线
###获取降解数据
data.deg <- AffyRNAdeg(data)
# 载入一组颜色
colors <- brewer.pal(4, "Set3")
##这里的4代表是4种颜色如果simple的数量超过4时，要更改数量。
# 绘制RNA降解图
plotAffyRNAdeg(data.deg, col=colors)
legend("topleft", rownames(pData(data)), col=colors, lwd=1, inset=0.05, cex=0.5)

6、从聚类分析角度查看数据质量（PCA）
芯片数据标准化（基于RMA和gcRMA两种方法），crma来对数据进行预处理。
library(affycoretools)
###使用gcrma算法来预处理数据
CLLgcrma<-gcrma(data)
# 提取基因表达矩阵
eset<-exprs(CLLgcrma)
# 计算样品两两之间的Pearson相关系数
pearson_cor<-cor(eset)
# 得到Pearson距离的下三角矩阵
dist.lower<-as.dist(1-pearson_cor)
# 聚类分析
hc<-hclust(dist.lower,"ave")
plot(hc)

######## pca分析
x= paste("sclc.Tumer", 1:2, sep = "-")
y=paste("sclc.N", 1:2, sep = "-")
z=c(x,y)
##z是一个向量，将样本进行定义，用于下面的因子转化。
samplenames<-sub(pattern="\\.CEL.gz", replacement = "",colnames(eset))
groups<-samplenames
library(ggplot2)
install.packages("FactoMineR")
install.packages("factoextra")
##自定义一个函数
pca_plot = function(dddd,ggggg){
library("FactoMineR")
library("factoextra")
df.pca <- PCA(t(dddd), graph = FALSE)
fviz_pca_ind(df.pca,
#axes = c(2,3),
geom.ind = "point",
col.ind = ggggg ,
addEllipses = TRUE,
legend.title = "Groups"
)
}
##将结果可视化。画出pca图
pca_plot(eset,groups)

第二步：背景矫正（去除背景噪声）
Affy基因芯片基础知识：Affy基因芯片的探针长度为25个碱基，每个mRNA用11~20个探针去检测，这一组探针叫做probe sets。探针较短，为保证特异性，设计了两种探针，一类探针与基因完全匹配，PM probes，另一类为不匹配的探针，MM probes。PM和MM探针成对出现，，可以用函数查看每个探针的检测情况。
背景处理：去除芯片背景噪声，MAS和RMA为最常用两种方法。
##用pm和mm函数可查看每个探针的检测情况
mm.data.raw <- mm(data)
head(mm.data.raw, 2)
pm.data.raw <- pm(data)
head(pm.data.raw, 2)
###上面显示的列名称就是探针的名称。而基因名称用probeset名称表示：
head(geneNames(data))
##probeset不一定和实际基因一一对应，这些后面对探针进行基因名称映射时会看到。
##使用RMA方法消减芯片背景噪声。
data.rma <- bg.correct(data, method="rma")
##使用MAS方法消减芯片背景噪声。
data.mas <- bg.correct(data, method="mas")
###MAS方法应用后PM和MM的信号强度都被重新计算。
###RMA方法仅使用PM探针数据，背景调整后MM的信号值不变。

第三步：归一化处理
同一个RNA样本用相同类型的几个芯片进行杂交，获得的结果不可能完全相同，甚至差别很大，为使不同芯片获得的结果具有可比性，需进行归一化处理。
##1、线性缩放方法常数（constant）
data.mas.ln <- normalize(data.mas, method = "constant")
##线性缩放方法以第一块芯片为参考，它的数值没有被处理，
##而其他芯片都被缩放了。对同一块芯片，不同探针的缩放倍数是一个常数（constant）
##2 非线性缩放方法
data.mas.nl <- normalize(data.mas, method = "invariantset")
## 3 分位数（quantile）方法
data.mas.qt <- normalize(data.mas, method = "quantiles")

第四步：汇总
使用合适的统计方法通过probe sets的杂交信号计算出基因的表达量
eset.rma.liwong <- computeExprSet(data.mas.qt, pmcorrect.method="pmonly", summary.method="liwong")