高通量测序在物种鉴定中的应用

什么是高通量测序技术？

高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。

桑格尔法（第一代测序的代表）测序原理：

DNA测序原理（1）——Sanger 法测序 - 知乎 (zhihu.com)

+峰度图

二代测序技术：

对于高通量测序的解释：

高通量是相对于第一代测序的，第一代测序只能一次测1个样品的1段序列，产生的数据量相对来说很小，而高通量测序一次能够产生的数据量在几十G上百G，可以一侧测很多的样本，或者测一个人的全基因组序列。打个比方，一代测序一次测序只能够对1个基因进行测序，而高通量测序能够一次检测几十甚至几百个基因，这就是高通量，同时产生的数据也很巨大，一代测序一次测几百bp，高通量测序一次测几个Gbp。

一代、二代、三代测序技术原理与比较 - 知乎 (zhihu.com)

20160405 illumina 测序原理介绍 - 知乎 (zhihu.com)

二代测序原理（Illumina） - 知乎 (zhihu.com)

靶向测序

微生物组学研究手段概览——扩增子测序 – 聚生物 (jushengwu.com)

比较16S扩增子测序与宏基因组测序的差别

From 16S rDNA测序 To 宏基因组学研究—技术发展及异同点 (360doc.com)

选用16s/18sDNA/ITS扩增子的原因：

根据不同的研究需求，一般选择扩增16S高变区来区分环境样品的细菌和古菌群落，ITS区域扩增用以评估真菌群落，原生动物等为主的真核微生物群落研究可通过18S高变区测序来实现。此外，也可通过特定的功能基因测序等来揭示特定功能相关的环境微生物群落分布。

细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。其中，5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种属的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；而16S rRNA普遍存在于原核细胞中，种属内具有高度的保守性，且含量较高、拷贝数较多，遗传信息量适中，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，非常适合作为细菌多样性分析的标准。

真核细胞核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；真核细胞中的18S rRNA是16S rRNA的同源RNA，18S rRNA除了比16S rRNA稍长且多一些臂和环结构外，两者空间结构十分相似，在核糖体中起到的作用也基本相同。

几十年以来细菌16S以及真核生物18S小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）一直是研究微生物多样性以及进化生物学系统发育树构建的标准标记基因。

ITS(internal transcribed spacer)为核糖体基因内间隔区，ITS分为两个区域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。ITS1 和ITS2作为非编码区,承受的选择压力较小,相对变化较大,并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。

16S/18S/ITS扩增子测序 - 乎 (zhihu.com)

分析的具体流程：

1.物种注释

微生物多样性（扩增子/16S rDNA测序）—OTU聚类与物种注释方法描述 - 知乎 (zhihu.com)

扩增子，物种注释四部曲 - 知乎 (zhihu.com)

WGS

WGS技术能够准确区分菌株间的基因组差异，且具有高度的重现性，不仅可以用于预期的单核细胞生长监测，还可以用于其他与公共卫生相关的病原体报告，是细菌分离物暴发监测和调查的有力工具。WGS测的是微生物的整个基因组序列，获得的信息很全面，但也因此依赖于对微生物的分离培养，耗时费力。微生物的群体特性需要深度测序才能准确的检测，这对于全基因组测序来说成本会很高。

微生物全基因组测序可用于鉴定和发现新生物体或鉴定特定的细菌生物体。随着测序技术的发展及测序成本的降低，传统的鉴定分型方式正在被基于全基因组测序数据的分析方法所取代，如菌种鉴定、血清型分析、ST型分析，耐药和毒力基因分析及表型预测等均可通过WGS数据分析的方式获得，相比于常规血清分型、药敏试验，WGS 方法可批量分析沙门氏菌的血清型和耐药性，具有效率高、准确率高、操作简便的优势，在沙门氏菌流行病学的研究中具有较高的应用价值。

https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2021&filename=WSYJ202105034&uniplatform=NZKPT&v=R8Njh_UUxcF9qz8drFroi07wz85lNp0Z0l_Jhmf4hAVLyvf5YfpxlIaeIvzQGdoe

与上者的差异

1.基因组组装方面难度较大

2.比对的方面更加地广

mNGS

概念：

广义宏基因组：是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。它是以生态环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律的一门科学。

狭义宏基因组：则以生态环境中全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和不可培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，揭示其规律。

※由于狭义宏基因组学概念的对象具体、范围局限和研究目标明确，一般文献上所提的宏基因组学，除非特别指明，一般均指的是狭义宏基因组学。

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