《全基因组测序WGS数据分析——1.DNA测序技术》

WGS(Whole Genome Sequencing)

• 指将物种细胞里面完整的基因组序列全部DNA，检测并排列，此技术几乎能够鉴定出基因组上任何类型的突变。

• 对于人类来说，全基因组测序的价值是极大的，它的信息包含了所有基因和生命特征之间的内在关联性，当然也意味着更大的数据解读和更高的技术挑战。

• 测序，简单来说就是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号。

第一代测序技术——sanger法

• Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术，又称为SBS法、末端终止法。1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。

原理和特点

• 由于ddNTP（4种带有荧光标记的A,C,G,T碱基）的 2’和3’都不含羟基 ，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来 中断DNA的合成反应 ，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有 放射性同位素标记 的ddNTP（分别为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），然后利用 凝胶电泳和放射自显影 后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

• 在每个反应体系中，ddNTP相对于dNTP是很少的，所以只有部分新链在不同的位置特异性终止，最终就会得到一系列长度不一的序列。

• 然后对这些DNA片段的混合物进行纯化，也就是去除掉游离的核苷酸和上面游离ddNTP的对这些混合物进行跑胶电泳分析，不同质量的会在电泳上排列在不同的位置，质量小的在上面，重的在下面，最后按顺序对每个序列检测尾部的荧光颜色序列读取每一个的颜色，就可以得到整个DNA片段序列信息了。

• 第一代测序技术的主要特点为， 测序读长可达1000bp ， 准确性高达99% 。但是 费用高 ， 通量低 ，是 先合成，再测序 的方法。
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第二代测序技术——illumina

• 第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性。第二代测序技术的核心思想是 边合成边测序 （Sequencing by Synthesis）。
• 第二代测序技术在 大幅提高了测序速度 的同时，还 大大地降低了测序成本 ，并且 保持了高准确性 ， 以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周 ，但其序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有 100bp-150bp 。
• 第一代和第二代测序技术测序成本作了一个简单的比较，可以看出自第二代测序技术发展出来之后，历史开始发生根本性的改变，测序的成本开始快速实现断崖式下降，也就是业内经常提到的 超摩尔定律 现象。

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原理和特点

• Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终止)的核心技术是 DNA合成的可逆性末端循环，即3’-OH可逆性的修饰和去修饰。

目前illumina的测序仪占全球75%以上，以HiSeq系列为主。它的机器采用的都是 边合成边测序 的方法，主要分为以下4个步骤：

step1 构建DNA测序文库

• 简单来说就是把一堆乱糟糟的 DNA分子用超声波打断成一定长度范围的小片段 。目前除了一些特殊的需求之外，基本都是打断为 3