Temsirolimus 是 mTOR 的抑制剂 |MedChemExpress (MCE)

中文名：替西罗莫司

CAS：162635-04-3

品牌：MedChemExpress (MCE)

存储条件：4°C, protect from light, stored under nitrogen

生物活性：Temsirolimus 是 mTOR 的抑制剂，IC50 为 1.76 μM。 Temsirolimus 在动物模型中激活自噬 并防止心脏功能恶化[8]。 IC50 和靶标：IC50：1.76 μM (mTOR)  

体外：Temsirolimus 有效抑制 mTOR 激酶活性，IC50 为 1.76 μM，类似于 rapamycin 在没有 FKBP12 的情况下 IC50 为 1.74 μM。 Temsirolimus（10 nM 至 <5 μM）通过 FKBP12 依赖性机制显示适度和选择性的抗增殖活性，但可以在低微摩尔浓度（5-15 μM）下完全抑制大量肿瘤细胞的增殖，涉及 FKBP12 非依赖性抑制 mTOR 信号。微摩尔而不是纳摩尔浓度 (20 μM) 的替西罗莫司处理导致整体蛋白质合成和多核糖体分解的显着下降，同时翻译延伸因子 eEF2 和翻译起始因子 eIF2A 的磷酸化迅速增加[1]< /sup>。替西罗莫司抑制核糖体蛋白 S6 的磷酸化，在 PTEN 阳性 DU145 细胞中比在 PTEN 阴性 PC-3 细胞中更有效，并以浓度依赖性方式抑制两种细胞的细胞生长和克隆形成存活[2]< /sup>。 Temsirolimus (100 ng/mL) 有效抑制原代人淋巴细胞白血病 (ALL) 细胞的增殖并诱导细胞凋亡[3]。

体内：CCI-779（20 mg/kg，腹腔注射）抑制两种前列腺癌异种移植物的生长，PC-3 肿瘤的生长以剂量依赖性方式受到抑制，并且生长抑制作用大于 DU145 肿瘤[2 ]。在具有人类 ALL 的 NOD/SCID 异种移植模型中，10 mg/kg/天的替西罗莫司治疗导致外周血母细胞减少和脾肿大[3]。与对照组相比，Temsirolimus（20 mg/kg，ip 5 天/周）给药后 1 周后 DAOY 异种移植物的生长显着延迟 160%，2 周后延迟 240%。单次大剂量 Temsirolimus (100 mg/kg, ip) 治疗可在 1 周内诱导 37% 的肿瘤体积消退。替西罗莫司治疗 2 周还将耐雷帕霉素 U251 异种移植物的生长延迟了 148%[4]。在亨廷顿病小鼠模型中，替西罗莫司对 mTOR 的抑制可提高四种不同行为任务的表现并减少聚集体形成[5]。给药替西罗莫司可诱导显着的剂量依赖性抗肿瘤反应，对抗 8226、OPM-2 和 U266 异种移植物的皮下生长，8226 和 OPM-2 的 ED50 分别为 20 mg/kg 和 2 mg/kg , 它们分别与抑制增殖和血管生成、诱导细胞凋亡和缩小肿瘤细胞大小有关[6]。

激酶试验：将带有 Flag 标签的野生型人类 mTOR (Flag-mTOR) DNA 构建体瞬时转染至 HEK293 细胞中。 48小时后进行Flag-mTOR的蛋白质提取和纯化。在 96 孔板中，在存在不同浓度的 Temsirolimus（不含 FKBP12）的情况下，对纯化的 Flag-mTOR 进行体外激酶测定，并使用 His6-S6K1 作为底物，通过解离增强镧系元素荧光免疫测定 (DELFIA) 进行检测。首先将酶在激酶测定缓冲液（10 mM Hepes (pH 7.4)、50 mM NaCl、50 mM β-甘油磷酸、10 mM MnCl2、0.5 mM DTT、0.25 μM 微囊藻毒素 LR 和 100 μg/mL BSA）中稀释。将 12 μL 稀释酶与 0.5 μL Temsirolimus 短暂混合到每个孔中。通过添加含有 ATP 和 His6-S6K 的 12.5 μL 激酶测定缓冲液来启动激酶反应，最终反应体积为 25 μL，其中含有 800 ng/mL FLAG-mTOR、100 μM ATP 和 1.25 μM His6-S6K。将反应板在室温下轻轻摇动孵育 2 小时（1-6 小时呈线性），然后添加 25 μL 终止缓冲液（20 mM Hepes (pH 7.4)、20 mM EDTA 和 20 mM EGTA）终止反应。使用铕-N1-ITC (Eu) 标记的单克隆抗 P(T389)-p70S6K 抗体（每个抗体 10.4 Eu）在室温下对磷酸化 (Thr-389) His6-S6K 进行 DELFIA 检测。将 45 μL 终止的激酶反应混合物转移至含有 55 μL PBS 的 MaxiSorp 板中。 His6-S6K 允许附着 2 小时，然后吸出孔并用 PBS 洗涤一次。添加 100 μL 含有 40 ng/mL Eu-P(T389)-S6K 抗体的 DELFIA 缓冲液。轻轻搅拌，抗体结合持续 1 小时。然后将孔吸出并用含有 0.05% Tween 20 (PBST) 的 PBS 洗涤四次。将 100 μL DELFIA 增强溶液添加到每个孔中，并在 PerkinElmer Victor 型读板器中读取板的读数。

细胞试验：各种治疗后前列腺癌细胞的存活率也通过集落形成测定来确定。将指数生长的细胞暴露于不同剂量的米托蒽醌或多西他赛 24 小时，或暴露于 CCI-779 3 天。处理后，洗涤细胞并用胰蛋白酶消化。将连续稀释液接种在 6 孔板中的 5 mL 培养基中。将板在 37°C、含 5% CO2、90% 湿度的气氛中孵育 10 天。然后用亚甲蓝对板进行染色，并对含有 > 50 个细胞的集落进行计数。

动物体内实验:为了生成异种移植物，将细胞植入基质胶中；基质胶储存于-20°C，然后在使用前在4°C的冰上解冻3小时。将细胞轻轻重悬于 1 mL PBS 中，并在冰上孵育 5 分钟。使用预冷的移液器将细胞转移至含有1 mL基质胶的管中，并将细胞浓度调节至3×107/mL。使用 25 号针将细胞（0.1 mL 中的 3×106 个）皮下注射到小鼠的两侧。当异种移植物长到直径约5毫米时，将动物随机分为10只小鼠的组。进行以下实验：用CCI-779（每天每公斤1、5、10和20毫克）或载体溶液治疗携带PC-3肿瘤的小鼠，每周3或5天，持续3周。携带 DU145 肿瘤的小鼠仅接受 CCI-779（每天每公斤 20 毫克）或载体溶液治疗 3 周。携带 PC-3 肿瘤的小鼠接受以下治疗：（a）对照，CCI-779 的载体溶液； (b)单独化疗，每周腹膜内注射米托蒽醌1.5mg/kg或多西紫杉醇10mg/kg，共3剂； (c)单独的CCI-779，每天腹膜内注射5或10mg/kg，每周3次，持续3周； (4)化疗后采用CCI-779。

 参考详情：www.medchemexpress.cn/Temsirolimus.html

参考文献：

[1]. Shor B, et al. A new pharmacologic action of CCI-779 involves FKBP12-independent inhibition of mTOR kinase activity and profound repression of global protein synthesis. Cancer Res, 2008, 68(8), 2934-2943.

[2]. Wu L, et al. Effects of the mammalian target of rapamycin inhibitor CCI-779 used alone or with chemotherapy on human prostate cancer cells and xenografts. Cancer Res, 2005, 65(7), 2825-2831.

[3]. Teachey DT, et al. The mTOR inhibitor CCI-779 induces apoptosis and inhibits growth in preclinical models of primary adult human ALL. Blood, 2006, 107(3), 1149-1155.

[4]. Geoerger B, et al. Antitumor activity of the rapamycin analog CCI-779 in human primitive neuroectodermal tumor/medulloblastoma models as single agent and in combination chemotherapy. Cancer Res, 2001, 61(4), 1527-1532.

[5]. Ravikumar B, et al. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat Genet. 2004 Jun;36(6):585-95. Epub 2004 May 16.

[6]. Frost P, et al. In vivo antitumor effects of the mTOR inhibitor CCI-779 against human multiple myeloma cells in a xenograft model. Blood. 2004 Dec 15;104(13):4181-7. Epub 2004 Aug 10.

[7]. Dela Cruz FS, et al. A case study of an integrative genomic and experimental therapeutic approach for rare tumors: identification of vulnerabilities in a pediatric poorly differentiated carcinoma. Genome Med. 2016 Oct 31;8(1):116.

[8]. Jason C. Choi, et al. Temsirolimus activates autophagy and ameliorates cardiomyopathy caused by lamin A/C gene mutation. Sci Transl Med. 2012 Jul 25; 4(144): 144ra102.