转录组分析小故事丨什么是RNAseq？

最新推荐文章于 2024-11-03 17:59:19 发布

生信分析笔记

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揭开转录组分析的面纱

亲爱的读者:

欢迎来到生物信息奇妙之旅！我是您的导航员，今天将带您走进玉米的微观世界，一探真核生物有参转录组分析的秘密。

想象一下，我们将穿梭于DNA与RNA的世界，用数据的眼睛揭示生命的奥秘，多么酷~

起始线：测序数据

我们的旅程从获取测序数据开始。假设你已经从高通量测序平台获得了玉米的RNA-Seq数据。

通常，这些数据以FASTQ格式呈现，包含大量的短序列读取。

数据清洗：去除噪音

首先，我们需要用Trimmomatic等工具清洗数据。

为什么呢？因为原始数据中可能夹杂着适配器序列和低质量读取。以下是一个示例代码：

java -jar trimmomatic PE -phred33 \
  input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz \
  output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz \
  output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz \
  ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

核心阶段：读取比对

接下来，我们需要将清洗后的读取比对到参考基因组。这里我们使用HISAT2，一款高效的比对工具。代码如下：

hisat2 -p 8 
-x maize_reference 
-1 output_forward_paired.fq.gz 
-2 output_reverse_paired.fq.gz 
-S maize_aligned.sam

组装转录本：拼凑基因的故事

使用StringTie对比对后的SAM文件进行转录本组装，这就像是将散落的碎片拼凑成完整的故事。

stringtie -p 8 
-G maize.gtf 
-o maize_transcripts.gtf 
-l maize maize_aligned.sam

表达量化：星光大道

现在，我们使用StringTie来估计转录本的表达量，输出TPM（每百万转录本数）表达矩阵。

stringtie -e -B 
-p 8 -G maize.gtf 
-o maize_gene_abundances.gtf 
maize_aligned.sam

差异表达：寻找线索

最后，是时候进行差异表达分析了。我们可以使用DESeq2在R环境中进行这一步。首先，安装并加载DESeq2包。

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("DESeq2")
library(DESeq2)

接着，导入TPM数据并使用DESeq2进行分析。

# 假设TPM数据存储在一个名为maize_TPM.csv的文件中
tpm_data <- read.csv("maize_TPM.csv", row.names = 1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = tpm_data,
                              colData = sample_info,
                              design = ~ condition)
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds)

最后，我们可以选取有意义的基因进行深入分析。