limma包的使用技巧

limmar package是一个功能比较全的包，既含有cDNA芯片的RAW data输入、前处理（归一化）功能，同时也有差异 化基因分析的“线性”算法（limma: Linear Models for Microarray Data），特别是对于“多因素实验（multifactor designed experiment）”。limmar包的可扩展性非常强，单通道（one channel）或者双通道（tow channel）数据都可以分析差异基因，甚至也包括了定量PCR和 RNA-seq （第一次见分析microarray的包也能处理RNA-seq）。

limmar package是一个集大成的包，对载入数据、数据前处理（背景矫正、组内归一化和组间归一化都有很多种选择方法）、差异基因分析都有很多的选择。而且，所设计的线性回归和经验贝叶斯方法找差异基因非常值得学习。

1. 读入样本信息

使用函数读 readTargets(file="Targets.txt", path=NULL, sep="\t", row.names=NULL, quote="\"",...)。这个函数其实是一个包装了的 read.table()，读入的是样本的信息，创建的对象类似于 marray包的marrayInfos和 Biobase包的AnnotatedDataFrame。

2. 读入探针密度数据 

与 marray包一致，Bioconductor不能读入原始的TIFF图像文件，只能输出扫描仪输入的、转换成数字信号的文本文件。使用函数 read.maimages(files=NULL, source="generic", path=NULL, ext=NULL, names=NULL, columns=NULL, other.columns=NULL, annotation=NULL, green.only=FALSE, wt.fun=NULL, verbose=TRUE, sep="\t", quote=NULL, ...)

参数说明：files需要通过函数 dir(pattern = " Mypattern ")配合正则表达式筛选（规范命名很重要），同时该函数 可以读入符合格式的压缩过的文件，比如*.txt.gz的文件，这极大的减小的数据储存大小；source的取值分为两类，一类是“高富帅”，比如“agilent”、“spot”等等（下表），它们是 特定扫描仪器的特定输出格式；如果不幸是“屌丝”，即格式是自己规定的，可以选定source="generic"，这时需要规定columns；任何cDNA文件都要有R/G/Rb/Gb四列（Mean或者Median）；annotation可以规定哪些是注释列；wt.fun用于对点样点进行质量评估，取值为0表示这些点将在后续的分析中被剔除，取值位1表示需要保留，对点样点的评估依赖于图像扫描软件的程序设定，比如SPOT和GenePix软件，查看QualityWeights（现成函数或者自己写函数）。

读入单通道数据：读入单通道数据，可以设定green.only = TRUE即可，然后对应读入columns = list(G = "Col1", Gb = "Col2")。

读入的数据，如果是单通道，则成为EListRaw class；如果是双通道，则是RGList class。

数据操作：

cbind()：合并数据；

“ [”：分割数据；

RGList class有的names是 "R"，"G"，"Rb"，"Gb"，"weights"，"printer"，"genes"，"targets"，"notes"：  R/G/Rb/Gb分别红和绿的前景和背景噪音；weight是扫描软件的质量评估；printer是点样规则（printer layout）；genes是基因注释；target是样本注释；notes是一般注释。可以通过 myRGList $ names进行相应的 取值和赋值。

3. 前处理

cDNA芯片前处理的流程是：背景去除（background correction）--> 组内归一化（with-array normalization）--> 组间归一化（between-array normalization）。最后一步组间归一化可选，注意trade-off原则。

3.1 背景去除： 

backgroundCorrect(RG, method="auto", offset=0, printer=RG$printer, normexp.method="saddle", verbose=TRUE)

RG：可以是EListRaw，也可以是RGList class；

method：取“ auto”，“ none”，“ subtract”， "half"