基于eXpress对转录组和基因组进行量化

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General workflow

eXpress是一个通用的丰度估计工具，它可以应用于任意靶序列和高通量测序reads。 靶序列可以是任意基因组区域，例如RNA-seq中的转录本。因此，一般的流程应该是这样的：

1. 选择你要分析的数据

2. 产生靶序列的集合

3.将目的片段比对到靶序列上

4. eXpress需要的参数包括目的片段，然后进行靶序列的丰度估计

5. 额外的下游分析

图示:

这个教程涉及如下工具:

• Gene Expression Omnibus (GEO) - 取得数据
• The Short Read Archive (SRA) -取得数据
• SRA Toolkit - 从压缩的测序数据中抽取FASTQ文件
• UCSC Genome Browser - 取得注释信息
• Bowtie - 进行比对
• Bowtie 2 -进行比对
• eXpress - 靶序列丰度估计

其它有用的工具（不限于RNA-seq）还包括  here .

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例子: 没有参考基因组序列也没有注释信息的情况

有的时候，你将研究没有参考基因组序列的物种，或者参考序列质量较差。这通常意味着你也没有转录组序列。下面要进行的步骤经常是从头组装转录组。接下来，我们将使用Bowtie2进行片段比对。

取得数据

为了取得一个数据，我们将使用GEO访问号。如果你没有一个GEO访问号，而是仅仅想要浏览数据，你可以跟随这个tutorial。为了演示的目的，我们将要研究牦牛转录组。

为什么选择牦牛呢？因为牦牛是天生没有气味的。事实上，是牦牛毛无味。为了下载数据，就直接去GEO吧，然后在"GEO accession" 输入访问号“GSE33300”，点击“GO”。

这将将你带到主实验页面。可以看到有6个来自不同器官的不同的样品。我们先看一下"GSM823609 brain"。点击这个实验，并点击ftp链接下载SRA文件。点击目录可以看到SRR361433.sra. 这是一个paired end的RNA-seq数据，我们将使用如下命令抽取数据

[text]  view plain copy

1. $ fastq-dump --split-3 SRR361433.sra  

结果产生两个文件， SRR361433_1.fastq和 SRR361433_2.fastq . 注意到使用  --split-3 . 只有当你下载的数据是paired end的情况下才需要用这个参数. 

通过从头组装进行注释

在这个演示中，我们花点时间进行一个完全从头组装分析，而不使用基因组信息，使用的工具是 Trinity .
使用如下参数运行Trinity :

[text]  view plain copy

1. $ Trinity.pl --seqType fq --JM 200G --left SRR361433_1.fastq --right SRR361433_2.fastq --CPU 2  

在几个小时内，我们将在trinity_out_dir中得到几个文件 , 包括注释文件 Trinity.fasta .这将是新的注释文件. 从这里开始，如果你有参考基因组的情况下，分析将大致相同（下面的例子也是一样的）.

从这里，可以下载组装文件.

比对

建立索引

在你进行任何比对之前，你首先需要建立靶序列的一系列索引文件.

[text]  view plain copy

1. $ cd trinity_out_dir  
2. $ bowtie2-build --offrate 1 Trinity.fasta Trinity  

这将在trinity_out_dir中建立索引，base name是 Trinity，bowtie2需要的参数只需要写到base name结束即可，不需要后面的部分 . 这个索引将允许bowtie2快速将reads比对到靶序列。Offrate 1可以加快比对速度，代价是需要的硬盘空间增大.

进行比对

使用一行命令即可运行bowtie2,

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1. $ bowtie2 -a -X 800 -p 4 -x trinity_out_dir/Trinity \  
2.     -1 SRR361433_1.fastq -2 SRR361433_2.fastq | samtools view -Sb - > hits.bam  

• -a - 想让bowtie2报告所有的比对可用此参数，适用于转录组分析，不适用于比对到基因组的分析(eXpress将处理多比对的问题，非常慢！)
• -X 800 - 将设置片段长度（fragment length）不超过800（实际的应用一般设置到300以内就可以了）. 这个设置将完全将RNA-seq的测序片段纳入分析的范畴
• -p 4 - 使用4个CPUs进行比对。你应该尽可能多的使用多个CPUs以加快速度.
• -x ... - Bowtie 2索引
• -1 ... -2 ... - RNA-seq实验的左reads和右reads

几十分钟到几小时后(取决于你使用多少CPUs), 你应该看到如下控制台信息:

[text]  view plain copy

1. [samopen] SAM header is present: 165714 sequences.