Nature Neuroscience：一个用于大鼠大脑功能连接分析的共识协议

以动物模型为基础的非任务态功能连接性研究为在可控条件下检验连接性现象提供了实验框架，并允许与通过侵入性或终末程序收集的数据模态进行比较。目前，动物数据的采集使用不同的协议和分析方法，这阻碍了结果的比较和整合。在此，我们介绍了StandardRat，这是一个经20个中心测试的大鼠功能磁共振成像采集共识协议。为开发这个具有优化采集和处理参数的协议，我们最初汇集了来自46个中心的65个大鼠功能成像数据集。我们开发了一个可重复的管道，用于分析通过不同协议采集的大鼠数据，并确定了与跨中心稳健检测功能连接性相关的实验和处理参数。我们证明，相比先前的采集方法，这个标准化协议增强了生物学上合理的功能连接模式。这里描述的协议和处理管道已公开与神经影像学界共享，以促进互操作性和合作，共同应对神经科学中最重要的挑战。本文发表在Nature Neuroscience杂志。

主要内容

     理解大脑需要跨空间和时间尺度的多层次方法。任务无关功能磁共振成像(fMRI)揭示的独特大脑网络特征在理解健康大脑功能和疾病机制中起着核心作用。这种血液动力学读出方法依赖于血氧水平依赖对比信号的自发波动来推断大脑的功能连接性(FC)。人类神经影像学通过专注于任务无关fMRI数据的开放数据共享倡议在理解大脑方面取得了巨大进展。尽管如此，动物模型，特别是小型啮齿动物，由于可以在基因控制的动物上进行侵入性和终末操作，继续在神经科学发现中发挥重要作用。例如，由于药物代谢的相似性，大鼠常用于药理学研究，以及由于它们在学习复杂任务方面的高熟练度，常用于行为神经科学研究。通过利用与人类相同的神经影像学方法和指标，啮齿动物的任务无关神经影像学可能为仅在动物模型中可能的侵入性方法提供一个转化桥梁。

      人类神经影像学共享倡议导致了fMRI采集协议的标准化，有助于数据的传播、汇总和重用。相比之下，临床前神经影像学基本上仍然没有协调指南。动物数据采集在不同的协议下进行，涉及不同的品系、约束和麻醉条件、射频线圈设计和磁场强度。这些影响了结果和结论的泛化。提出采集和/或预处理协议的努力很少超出单个实验室的范围，因此限制了互操作性和广泛采用。由于fMRI在啮齿动物中研究全脑纵向连接性现象生物学基础的潜力，一个优化的共识协议可能会促进未来的科学发现。

      在这项预先注册的研究中，我们着手汇总并公开代表性数据集，这些数据集采用了大鼠的各种fMRI采集协议，并确定与稳健可靠的FC检测相关的实验参数。我们整理了MultiRat_rest集合（来自65个数据集的646只大鼠），代表了46个机构使用的协议。基于对MultiRat_rest集合的分析，我们设计了一个新的共识协议，并用它来汇总StandardRat集合（来自21个数据集的209只大鼠）。使用适合啮齿动物的fMRI预处理和分析工具，针对不同特征的啮齿动物数据定制了预处理和混杂因素校正。我们的主要结果是检测与生物学预期模型相对应的合理FC模式。通过整理来自50个中心和855只大鼠的数据，我们展示了标准化采集和相关的预处理流程优化了大鼠分布式fMRI网络的检测。与其他物种的大规模研究一致，我们已经自由发布了所有数据和生成的代码。

方法

预注册
      本研究已预注册。以下是值得注意的偏差。我们使用了SIGMA大鼠模板25而不是Papp等人的模板,因为前者的伪影较少、具有额外的相关益处,并改善了体内对比度。一些数据集的视野被裁剪以便于图像配准。一些数据集的时间序列被裁剪以减轻计算负担。我们使用了时间信噪比而不是信噪比,因为两者已被证明是相关的。

动物
      所有采集都在获得各自当地和国家伦理机构批准后进行。参与的实验室被指示提供n = 10只大鼠的成像采集,包括一次解剖结构和一次静息态功能扫描。排除标准是不适合RABIES预处理(例如,需要专门的图像重建和受限视野)。MultiRat_rest集合包括来自46个研究中心的n = 65个数据集和n = 646只大鼠(141/505雌性/雄性)。StandardRat包括来自20个研究中心的n = 21个数据集和n = 209只大鼠(93/116雌性/雄性)。为了比较,还包括来自单中心清醒大鼠数据集的224次扫描(n = 39只大鼠)。排除基于以下标准：图像误配准(扩展数据图2)、过度运动以及缺失或损坏的数据。

标准化fMRI采集协议
     标准化协议是基于MultiRat_rest分析结果确定的,并用于采集StandardRat数据集。采集主要在约2个月大的自由呼吸Wistar大鼠上进行,混合性别,使用4%异氟烷和0.05 mg kg−1美托咪定皮下(s.c.)注射诱导麻醉,0.4%异氟烷和0.1 mg/kg/h美托咪定s.c.维持麻醉。使用梯度回波-平面成像技术进行成像,在麻醉诱导40分钟后进行,重复时间= 1,000 ms,回波时间/翻转角/带宽根据场强定义(补充表1),重复次数= 1,000,矩阵大小[64 × 64],视野25.6 × 25.6 mm2,18个交错轴向切片,厚度1 mm,间隙0.1 mm。

    

数据预处理和混杂因素校正
    扫描按照BIDS格式组织。使用RABIES 0.3.5的可重复软件环境对每个扫描会话单独进行预处理。预处理使用autobox、N4不均匀校正、运动校正、功能和解剖扫描之间的刚性配准、解剖扫描和模板之间的非线性配准以及公共空间重采样至0.3 × 0.3 × 0.3 mm3。开发了体积（volume)图像配准和脑部掩膜工作流程,以解决啮齿动物图像中存在的脑大小、图像对比度和易感性畸变的差异。对所有扫描的预处理输出进行了目视检查以进行质量控制。测试了五种混杂因素校正模型,使用基于ICA-AROMA、白质和脑室信号或GSR(全局信号回归)的三种方法(补充表2)。这些与运动回归、空间平滑至0.5 mm3、0.01 Hz高通滤波和0.1 Hz或0.2 Hz低通滤波一起进行。ICA-AROMA方法从人类适应到大鼠,使用专门的大鼠脑脊液和脑边缘掩膜,并基于一组啮齿动物图像训练分类器参数。对组分及其分类的目视检查表明,少于5%的可信信号组分被错误地标记为噪声。

数据分析
      为确定个体大鼠的FC,使用RABIES在模板空间中进行基于种子的分析,使用直径0.9 mm的球形种子,位于S1bf（S1（初级体感皮层）桶状野区域）和ACA（前扣带区）、尾状壳核和初级运动区。功能连接计算为区域时间序列之间的Pearson相关系数。功能连接特异性相对于左S1bf种子定义,使用对侧右S1bf感兴趣区域作为特定感兴趣区域,ACA作为非特定感兴趣区域。对每只动物的FC进行评估,并分为四类:特异性(rS1bf左到右 > 0.1 且 rS1bf左到ACA < 0.1);非特异性(rS1bf左到右 > 0.1 且 rS1bf左到ACA > 0.1);无(rS1bf左到右 [-0.1, 0.1] 且 rS1bf左到ACA [-0.1, 0.1]);以及虚假连接(剩余情况)。为评估默认模式网络中的连接特异性,在ACA（前扣带区）中使用种子实施了相同的方法。特定感兴趣区域位于ACA(种子后方3.3 mm),非特定感兴趣区域位于S1bf。为评估全脑连接,使用Nilearn进行了n = 20个组分的组独立成分分析。使用Zerbi等人定义的标准评估组分的生物学合理性。为与人类比较,在7T人类连接组项目数据集上实施了相同的质量控制指标。FIX去噪扫描(n = 184名参与者)使用3dTproject进行带通校正(0.01–0.1 Hz)和平滑(2.5 mm2)。感兴趣区域位于感觉皮层和ACA。

统计和可重复性

       样本量是根据构成此集合的可用数据集确定的。未应用随机化。数据收集和分析并非对实验条件进行盲法处理。使用Nilearn 0.7.1 (参考文献31)估算了单样本t检验体素图和组独立成分分析。使用SciPy 1.6.2 (参考文献32)中实现的χ2检验确定FC特异性与分类变量(例如磁场强度、品系和性别)之间的比较。连续变量(例如平均帧间位移(MFW))被转换为六个分类bin,以允许与χ2检验进行比较。使用Pingouin 0.5 (参考文献33)进行线性回归和方差分析。个体基于种子的图以颜色编码叠加表示,阈值为r > 0.1。鉴于强调检测FC及影响它的因素,我们按照预注册规范,通过应用宽松的阈值Puncorrected < 0.05到单样本t检验图来减轻假阴性。这种阈值设置是合理的,因为我们不想排除任何可能存在微弱FC痕迹的数据集。切片位置以相对于前联合的毫米表示。

结果

      我们汇总了MultiRat_rest集合，这是代表本地站点采集程序的非标准化fMRI数据集（n = 65个数据集和n = 646只大鼠）。如预期，我们在所有记录的实验因素中发现高度异质性，包括大鼠特征（性别和品系，图1a,b，以及年龄和体重，扩展数据图1），扫描中生理学（麻醉/清醒和呼吸率；图1c,e）和图像采集（磁场强度、序列和序列参数；图1d,f,g）。值得注意的是，性别偏差很大，偏向雄性（图1a）。同样，麻醉协议的分布也符合该领域的当前趋势（图1c）。尽管采集参数和随之而来的图像质量分布不均（图1g,h,i），646次扫描中的638次通过了预处理质量控制（一次扫描运动过度，一次空扫描，六次扫描图像配准失败；图1j,k和扩展数据图2）。作为进一步的质量控制，我们描述了时间信噪比（扩展数据图3）和运动参数（扩展数据图4）。总的来说，我们发现汇总的数据集代表了当前啮齿动物fMRI采集趋势。此外，鉴于由于误配准导致的排除率低，我们得出结论，尽管采集参数差异很大，RABIES工具箱可以有效地用于预处理大鼠数据集。这为跨站点的可重复和互操作数据处理铺平了道路。

图1：MultiRat_rest数据集描述

a. 性别。b. 品系。c. 麻醉。d. 磁场强度。e. 呼吸率作为麻醉的函数。f. 重复时间。g. 回波时间作为磁场强度的函数。h. 示例的切片位置。i. 代表性原始功能图像的示例。箭头指示杏仁核中不同的易感伪影相关的几何失真。j. 成功的解剖空间（上）到标准空间（下）的配准。红线表示标准图像（上）和解剖图像（下）的轮廓。k. 成功的功能空间（上）到解剖空间（下）的配准。红线表示解剖图像（上）和功能图像（下）的轮廓。

      我们专注于检查感觉皮层的FC，因为感觉网络在通常用于fMRI的麻醉深度范围内对麻醉效果的评估是稳健的。更具体地说，我们使用两个互补标准作为准确FC识别的指标来评估S1桶状野区域（S1bf）连接性的特异性（图2a,b）。第一个标准是半球间感觉皮层（桶状野，S1bf）之间的强连接。事实上，在人类和动物中，可以追溯到FC的最初描述，大多数网络，包括感觉-运动网络，都具有双侧同源组织。第二个标准是S1bf和前扣带区（ACA）之间的弱相关或反相关。ACA是任务负性啮齿动物默认模式网络的主要节点。任务正性（如S1bf相关的感觉网络17,18）和任务负性网络通常不相关或反相关19。

图2：FC特异性。
a. 图解说明FC特异性背后的逻辑。感觉（桶状野，S1bf）区域（蓝色）主要投射到对侧同源区域（浅蓝色），但不投射到ACA区域（紫色）。

b. 静息态信号中时间动态的示例。同侧和对侧S1bf之间的相关信号以及来自ACA的反相关信号。

c. FC类别分布作为混杂因素校正模型的函数。

d. 使用全局回归校正模型，左S1bf相对于特定（右S1bf）和非特定（ACA）感兴趣区域的FC。点代表扫描（n = 638只大鼠）；虚线表示用于划分类别的阈值。

e. 连接性类别分布作为麻醉的函数。每个连接性类别的个体种子基分析图的示例。

f. 连接性类别分布作为成像序列的函数（EPI，回波平面成像；GE，梯度回波；SE，自旋回波）。组水平FC发生率图（n = 65个数据集）。

g. 每个连接性类别的个体基于种子点分析图的示例。

a.u.，任意单位；ROI，感兴趣区域，WMCSFs，白质+脑脊液。

      根据上述两个标准，对每只动物的FC进行评估，并分为四类：特异性、非特异性、虚假和无连接。测试了五种混杂因素校正模型（补充表2和图2c）。全局信号回归（GSR）噪声模型在特异性连接检测方面表现最佳（40.8%的动物具有特异性连接，11.8%为非特异性，13.6%为虚假，33.9%不含可检测的FC；图2c,d,g）。为了测试特异性指标对其他网络的泛化性，我们对扣带皮层（啮齿动物默认模式网络的一个节点）实施了相同的质量控制指标，发现连接特异性较低（22.1%；扩展数据图5）。由于网络推断通常在组水平而非个体水平上评估，我们对每个数据集进行了单样本t检验，以估计组内检测到的对侧连接性相对于S1bf（S1（初级体感皮层）桶状野区域）种子以及其他三个种子的发生率（图3）。在65个数据集中，最多70%的数据集相对于种子呈现出有限的对侧连接性证据，50%的数据集在组水平上捕捉到了更大感觉网络的特征。我们得出结论，大鼠数据集并不能均等地捕捉FC，这与我们在小鼠中报告的情况类似。我们还发现，GSR(全局信号回归)增强了S1bf种子的特异性连接发生率，因此我们决定在剩余的分析中使用这种混杂模型。

图3：四个种子的组水平FC发生率（n = 65个数据集，每个数据集约10个受试）。
Cpu，尾状核-壳核；MOp，初级运动区。MOp和CPu种子通常在50-75%的数据集中观察到。

      我们的观察强调了需要改进采集协议，以最大化个体水平推断，从而促进实验网络神经科学的发现。为此，我们评估了与MultiRat_rest集合中特异性发生率增加相关的参数。由于我们的分析依赖于分类数据，我们使用χ2检验测试了四个连接性类别的预期频率分布与麻醉和序列类别的关系。美托咪定/异氟烷麻醉组合条件在被归类为特异性的扫描中富集（图2e；92/187次扫描，χ2检验连接性类别麻醉：φ = 0.27，自由度(dof) = 15，g = 92.38，P = 3.5 × 10−13）。使用梯度回波成像序列也与更高的特异性发生率相关（图2f；241/568次扫描，χ2检验连接性类别序列：φ = 0.11，dof = 3，g = 16.00，P = 0.001）。基于这些观察，我们设计了一个源自ds01031数据集（10次中9次特异性扫描）的麻醉协议和基于ds01028（10次中8次特异性扫描）的成像序列，在4.7T中场系统上采集。序列选择是合理的，因为它允许在该集合中使用的较低场系统之一上检测特异性连接，并且应该在更高场系统上也表现良好。我们根据场强优化了相关序列参数（回波时间、翻转角和带宽）（补充表1）。我们假设这个协议将增强功能特异性，同时与继续代表使用系统相关份额的较低场系统兼容（图1d）。

      使用这个共识协议，我们整理了在20个中心获得的21个数据集的StandardRat集合。这包括n = 209只大鼠（93/116雌性/雄性），主要是Wistar品系（189/209），年龄约2个月（扩展数据图6）。数据集采集在4.7T到17.2T的磁场强度范围内进行。预处理与非标准化数据集类似进行。总共207/209次扫描通过质量保证（两次由于图像误配准而被丢弃）。有趣的是，尽管使用相同的麻醉协议，但在fMRI采集开始时报告的呼吸率因大鼠品系而异（图4a,b；方差分析呼吸率大鼠品系，η2 = 0.24，F195,2 = 31.17，P = 1.8 × 10−12）。最后，磁场强度对时间信噪比的影响可以忽略不计（图4c；线性回归时间信噪比场强，系数 = 0.53 [−0.23, 1.30]，r2 = 0.01，dof = 201，T = 1.37，P = 0.17）。

图4：StandardRat数据集描述。
      a，呼吸率（bpm）作为品系的函数。b，MFW作为品系的函数。c，感觉皮层中的时间信噪比作为场强的函数。d，使用全局回归校正模型，左S1bf相对于特定（右S1bf）和非特定（ACA）感兴趣区域的FC。点代表扫描（n = 207只大鼠）；虚线表示用于划分类别的阈值。e，代表性独立成分。a.u.，任意单位。

      StandardRat研究的目标是改善个体数据集中特异性连接的检测。我们发现，使用GSR(全局信号回归)时，61.8%的扫描被归类为表现出特异性连接（图4d），而在具有非标准化采集的MultiRat_rest数据集中为40.8%（扩展数据图8a）（χ2检验连接性类别数据集集合：φ = 0.13，dof = 3，g = 33.01，P = 3.2 × 10−7）。当我们仅比较同时贡献给两个集合的中心的数据集时，这种差异仍然存在（χ2检验连接性类别数据集集合：φ = 0.17，dof = 3，g = 28.37，P = 3.0 × 10−6）。这与StandardRat集合由于贡献实验室的特征（例如，磁体类型或强度和更多的数据收集经验）而表现更好的观念相反。有趣的是，我们无法建立场强对连接特异性的影响（χ2检验连接性类别~场强：φ = 0.19，dof = 12，g = 14.89，P = 0.25），这表明采集系统并不是该协议的限制因素。我们得出结论，新标准化协议平均而言在检测生物学上合理的连接模式方面优于社区以前使用的协议。最后，为了探索全脑连接模式，我们在数据集水平上检查了四个选定种子的连接发生率（扩展数据图7）和组独立成分分析（图4e和扩展数据图10）。我们发现与MultiRat_rest数据集相比，数据集水平上远端连接检测有所改善，并且有证据表明先前描述的跨越全脑的啮齿动物网络。

      有趣的是，StandardRat集合中数据集之间的连接模式仍然存在差异。事实上，21个数据集中有5个达到了90%或更高的特异性。这强调了我们协议的潜力，但也突出了需要了解哪些因素阻碍了其他数据集。接下来，我们寻求确定与更高特异性连接模式发生率相关的变量。值得注意的是，我们无法建立品系、性别或磁场强度效应，这表明该协议适用于广泛的条件（补充表3）。接下来，我们检查了呼吸率和时间信噪比作为采集变异性的指标（扩展数据图9）。总的来说，在StandardRat集合中，呼吸率范围在84到114次/分钟（bpm）和皮质时间信噪比>53的扫描实现了更高的连接特异性发生率。这些提供了第一线证据，通过识别可以进一步增强连接性结果的做法来完善StandardRat协议。这些观察的重要性将需要在新数据集中得到确认，最好是跨多个中心，然后才能用新的指南更新StandardRat协议。

讨论

    我们整理了两个数据集集合(MultiRat_rest和StandardRat),对它们进行了分析,并将其作为开放获取资源。据我们所知,这些是目前可用的最大的啮齿动物fMRI数据集。我们开发并部署了一种可推广到大多数扫描和每个数据集的预处理和混杂因素校正策略。利用MultiRat_rest集合的信息,我们提供了有用的群体参数估计,以增强大鼠fMRI数据集的比较。我们提出并评估了一个新的标准化协议,发现这个共识采集和预处理流程在连接特异性方面优于以前的采集。为了允许复制并激发新的分析,我们向更广泛的社区发布所有原始和处理后的数据。

      平均而言,标准化协议相比MultiRat_rest集合中收集的先前采集有所改进。然而,个体水平的推断仍限于61.8%的采集扫描。作为比较,我们使用相同的质量保证指标估计7T人类连接组项目数据集(基于184次扫描)的特异性为55%5。这强调了基于生物学上合理的FC假设实施合理质量保证指标的重要性。通过理解导致成功采集的因素、改进的协议、预处理或干扰回归模型来提高输出质量,将导致切实的更好的结果,能够进一步增强未来的数据采集,并通过减少丢弃来减少动物使用。

      值得注意的是,我们的新协议依赖于轻度镇静来约束动物。虽然针对fMRI进行了优化,但此协议可能不适用于其他程序,如电生理学。我们还发现,现有的清醒约束协议平均导致特异性连接模式的发生率较低(扩展数据图8b)。先前的报告指出在一个清醒大鼠数据集中有类似的值，我们使用RABIES流程进行预处理确认了这一点(扩展数据图8b)。由于麻醉对网络的影响,开发清醒成像作为替代方案仍然至关重要。然而,应通过质量控制指标的视角检查这些协议,以确保始终如一地实现合理的连接模式。此外,心率等生理因素很少被报告。这限制了我们检查这些因素对连接结果可能贡献的能力。我们借此机会鼓励社区获取这些数据并在随后的出版物中报告它们。最后,StandardRat中的采集序列设计为在许多系统上运行。应该针对当前协议检查新序列的有效性—例如,各向同性分辨率或多波段采集。

      我们项目的方法学和概念进展是迈向大规模多中心大鼠神经影像采集的第一步。神经影像学和其他学科的协调开放科学项目正在改变科学格局。通过我们中心的共同努力,并由大大改进的协议增强,大鼠功能性脑成像已准备好应对神经科学和心理健康研究中的紧迫问题。