文献阅读---泰国盐胁迫反应和基于SNP的系统发育分析水稻品种

文献阅读—泰国盐胁迫反应和基于SNP的系统发育分析水稻品种

本文献于2022年1月发表
杂志：The Plant Genome
文章简写：
CMS
cell membrane stability
QTL
quantitative trait loci
RDW
root dry weight
RFW
root fresh weight
RIL
recombinant inbred line
RL
root length
RWC
relative water content
SDW
shoot dry weight
SES
standard salt injury evaluation system
SFW
shoot fresh weight
SI
stability index
SL
shoot length
SNP
single-nucleotide polymorphism

1. 摘要

遗传多样性对于开发耐盐性品种很重要。某些耐盐性品种在成年期和生殖期表现出耐盐性，但它们在幼苗期对盐分的反应尚不清楚。

本研究使用水培系统（hydroponic system）筛选了总共10个水稻品种/系，包括8个泰国品种和1个标准耐盐品种和1个敏感系，以鉴定幼苗期的耐盐基因型。

（1）使用不同的形态生理学指标（morphophysiological indicators ）对抗性和感性基因型进行分类，系统发育分析用来确定栽培品种的进化关系，结果表明，4个泰国品种（‘Lai Mahk’、‘Jao Khao’、‘Luang Pratahn’和‘Ma Gawk’）表现出与标准耐盐性检查‘Pokkali’相当的耐盐胁迫能力。基于全外显子组单核苷酸多态性 (SNP) 的系统发育分析表明，泰国水稻品种是单一起源的（monophyletic），与 Pokkali 和 IR29 远亲。

（2）在使用全外显子组 SNP 进行分析时，发现 Lai Mahk 和 Luang Pratahn 密切相关。分析来自 164 个耐盐基因和转录调节基因的 SNP 也是如此。

（3）耐受品种共有 16 个基因的相同单倍型。

总体而言，本研究的结果确定了4个耐盐胁迫的泰国水稻品种，可用于水稻耐盐育种计划。

2. 研究背景

水稻是盐敏感谷物之一，因无法调节根部Na离子流入，导致茎部Na离子毒性积累，影响植物的生长和产量。在盐胁迫下，叶片温度升高，气孔关闭抑制细胞伸长。此外，盐度会抑制种子发芽并导致叶绿体破坏，光合作用总体下降。研究表明，水稻幼苗极易受到盐胁迫的影响。耐盐性随着年龄和发育而增加，直到早期生殖阶段，水稻植株会再次变得易感。（研究进展）

栽培稻显示出高遗传变异性，对耐盐表现出多样性，这对于开发耐盐水稻品种可能很重要。前人研究了水稻品种种群和耐盐性的变化，耐盐水稻“Pokkali”和其他品种已被用于开发耐盐品种。有些地方，还是在当地种质中筛选抗性材料更好。（耐性品种）

水稻是泰国的主要作物，在泰国各地均有种植，然而，一些地区受到高土壤盐分的影响，特别是生产优质稻米的东北地区。前期研究了生殖生长阶段的耐盐性。一些种质，包括“Jao Khao”、“Luang Pratahn”和“Ma Gawk”，对盐胁迫具有高度耐受性，有可能在育种计划中用作开发新耐盐品种的供体。然而，这些品种在幼苗期盐胁迫条件下的表现尚不清楚。因此，本研究的目的是检查在幼苗期受到盐胁迫的 8 个泰国水稻品种的生长性能、物理损伤和细胞状态。此外，使用全基因组 SNP 和锚定在选定基因类别上的 SNP 检查栽培品种之间的系统发育关系。在这里，我们描述了这些泰国品种的耐盐表型以及它们的系统发育关系。这些数据与耐受性的多样化遗传基础一致，这一发现对于未来选择水稻品种进行耐盐育种计划很重要。（泰国情况，引出本文研究）

3. 材料与方法

3.1 材料
泰国水稻基因库提供了 8 个泰国当地水稻品种 KDML105、Ma Gawk、Jao Khao、“Mayom”、“Plah Khaeng”、“Gam Feuang”、“Luang Pratahn”和“Lai Mahk”的种子 ，泰国农业与合作部。 标准耐盐品种 Pokkali 和标准盐敏感品系 IR29 的种子。

3.2 水培和表型
该实验以随机完整区组设计进行，具有4个生物学重复，包括在盐胁迫和正常条件下生长的本研究中使用的 9 个品种和 1 个品系。每个重复包含每个栽培品种或品系的4株植物。
共有：10盆×4×2（每盆4株植物）

水稻幼苗在含有水培中，将 14 日龄幼苗逐步添加到营养液中进行盐胁迫处理，直到 6 d 后达到 12 dSm-1 (100 mM NaCl) 的盐度，然后再维持 6 d 。对照组的幼苗在不含NaCl的营养液中生长。

分别在处理后3、6、9、12 d进行评价植物表型，包括地上部鲜重 (SFW)、地上部干重 (SDW)、根鲜重 (RFW)、根干重 (RDW)、地上部株高 (SL)、根长 (RL)、细胞膜稳定性 (CMS) 、相对含水量（RWC）和标准盐害评价系统（SES）。

注意，其中的CMS即为EL（electronic leakage），电导率

3.3 SNP calling
外显子数据下载自网上公开数据。
SNP calling使用GATK haplotype caller (Auwera et al., 2013)、FREEBAYES (Garrison & Marth, 2012) 和 VARSCAN (Koboldt et al., 2013) 用于提取每个水稻品种/系的变异；3个工具中至少有2个匹配的位置是使用 vcf-isec (Danecek et al., 2011) 获得的，并使用 vcf-annotate 工具 (Danecek et al., 2011) 进行注释。

3.4 水稻基因组中特征耐盐基因确定
（1）查找文献
通过语义文献搜索查询文献（https://www.semanticscholar.org/）6000个，保存具有PubMed ID 的文献621篇，使用关键词“盐耐受性”和“水稻”进行并行 PubMed 搜索，以搜索包含所需信息的摘要，产生 511 篇论文。将621和511文献合并。

使用Bioreader（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?BioReader-1.2）网站查找相关文献，其中提供手动验证的阳性集合73个（相关），阴性集合73个（不相关）的PubMed ID进行训练，共鉴定212篇相关文献。

在212文献中搜索到108个相关基因，与在线网站中（https://funricegenes.github.io/；https://venyao.xyz/funRiceGenes/）耐盐和感盐的水稻基因结合，共找到164个水稻基因。
使用R语言GO富集分析发现，基因调控相关的基因聚类到一起，然后，将这组基因中的 SNP被整合到一个PHYLIP 比对文件。

（2）构建单倍型
对于每个基因，来自 R 包 GHap 的函数 ghap.happlotyping 用于从 SNP 数据中调用单倍型 (Utsunomiya et al., 2016)。为了可视化，使用带有网状树的种群分析 (PopART) 创建了一个单倍型网络，每个基因具有最小跨度网络推断方法 (Bandelt 等人，1999)。

计算所有成对栽培品种/系的每个基因中核苷酸差异的数量。接下来，使用欧几里得距离基于核苷酸差异计算成对相异矩阵。最后，对所有 101 个基因和一组单倍型与耐受性相关的基因进行基于相异矩阵的聚集层次聚类，即在耐受和敏感品种/系之间共享的单倍型，使用带有聚集方法的 hclust 函数R中的’ward.D2’。

3.5 统计分析
为了评估每个性状的压力稳定性指数的差异，使用SPSS Statistics 20软件进行基于一般线性模型的方差分析（ANOVA）和邓肯多范围检验的平均值比较。品种/品系被认为是固定因素，而每个性状都是一个可靠的变量。在 p < .05 时，方差分析结果被认为是显着的。

4. 研究结果

4.1 盐胁迫表型调查
在盐胁迫条件下，
（1）整体上Pokkali、Jao Khao、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Ma Gawk 的生长优于 IR29、Plah Khaeng、KDML105、Gam Feuang 和 Mayom。

（2）Pokkali的SFW和SDW的稳定性指数（SI）最高，在盐胁迫12 d后分别高于0.7和0.8，并不显著高于Jao Khao、Lai Mahk和Luang Pratahn的稳定性指数（SI）。
此外，在盐胁迫条件下， IR29、Plah Khaeng、KDML105、Gam Feuang 和 Mayom 的 SFW和SDW的稳定性指数（SI）下降了 >60%（图 1a-d）。
在盐胁迫 12 天后，IR29、Plah Khaeng、KDML105、Gam Feuang 和 Mayom 的 RFW（图 1e、f）和 RDW（图 1g、h）下降到约 40%。

（3）有趣的是，Lai Mahk 在盐胁迫 6 d 后的 RFW SI > 1，表明与正常条件下生长的植物相比，盐胁迫下的 RFW 增加；
此外，与其他品种相比，Lai Mahk 和 Jao Khao 在盐胁迫 12 d 后的 RFW 没有显着影响（图 1f）；
然而，在盐胁迫 12 天后测试的所有品种的 RDW 均显着下降（图 1g，h），SI指数均小于1。

根据 RDW 的下降百分比，品种分为三类：
Pokkali、Jao Khao、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Ma Gawk（下降 10-20%）；
KDML105、Gam Feuang 和 Mayom（减少 50-60%）；
IR29 和 Plah Khaeng，（>70% 减少）（图 1h）。

（4）植株长度（图 1i，j）和 RL（图 1k，l）与 SFW、SDW、RFW 和 RDW 显着相关。
在检查的参数中，Pokkali 幼苗的高度和SL 受盐胁迫的影响最小；但是，差异并不显着。
Pokkali 和 IR29 的 SL 分别下降了 16% 和 40%，表明 IR29 是对盐胁迫最敏感的材料（图 1j）。
此外，与正常条件下生长的幼苗相比，盐胁迫导致 Jao Khao、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Ma Gawk 的 SL 下降 20-26%，而 KDML105、Gam Feuang 的 SL 下降 29-40% ，和Mayom。
在 RL 方面，Lai Mahk 在 12 d 后受盐胁迫的影响最小，与正常条件下生长的幼苗相比，RL 仅下降 4%。相比之下，在盐胁迫条件下，Pokkali 和 IR29 的 RL 分别下降了 16% 和 48%，表明 IR29 最容易受到盐胁迫的影响（图 1l）。

4.2 盐胁迫诱导的细胞反应与生长状态相关
为了确定盐胁迫条件下栽培品种/品系的细胞状态，在盐胁迫12天后检查幼苗的CMS和RWC。
（1）结果表明，在盐胁迫 12 天后，Pokkali、Jao Khao、Lai Mahk、Ma Gawk 和 Luang Pratahn 的 CMS 值没有显着差异（图 2a、b），值范围为 89-95%。 相比之下，IR29、Plah Khaeng 和 Mayom 的 CMS 显着下降（50%）。 此外，KDML105 和 Gam Feuang 的 CMS 值分别为 73% 和 79%。 对于品种/系的 RWC 观察到类似的模式（图 2c，d）。 基于这两个参数，Pokkali 是最耐盐胁迫的品种，而 Plah Khaeng 是最易受盐胁迫的品种。

（2）使用 SES 测量整体地上表型表明，Pokkali 没有明显的损伤症状，SES 为 1（图 2e，f）。同样，Jao Khao、Lai Mahk 和 Luang Pratahn 对盐胁迫具有抗性，盐胁迫 12 天后 SES 值在 1.1 到 1.2 之间。相比之下，除 Ma Gawk 和 KDML105（SES 值分别为 1.7 和 4.3）外，其余品种受到盐胁迫的不利影响，SES 值>6.0（图 2e，f）。

评估的盐响应表型显着正相关（0.6311-0.9959），除了SES，在所有时间点与其他参数显着负相关（-0.9644至-0.601）（图3a；补充表S4）。表型数据的层次聚类分析将水稻品种/品系分为两个主要聚类（图 3b）。

这些结果表明泰国水稻种质具有不同程度的耐盐性，并将 Jao Khao、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Ma Gawk 确定为幼苗期的耐盐品种。

4.3 基于全基因组单核苷酸多态性的系统发育分析从泰国水稻材料中分离出标准的耐受性和敏感性材料
（1）为了确定所检查的水稻品种/系之间的遗传亲缘关系和变异，我们使用在 10 个品种/系中鉴定的 995,523 个 SNP 进行了基于全基因组 SNP 的系统发育分析。

系统发育树显示 8 个泰国当地水稻品种是单系的，因此与 Pokkali 和 IR29 不同（图 4a）。
耐盐品种 Ma Gawk 与对盐胁迫敏感的 Plah Khaeng 和 Gam Feuang 聚集在一起（图 4a）。

（2）为了探索泰国水稻耐盐性的潜在遗传组成，我们使用从水稻中报道的 164 个耐盐基因中获得的 888 个 SNP 进行了系统发育分析（补充表 S1 和 S2）。 与基于全外显子组 SNP 的系统发育分析的结果相反，使用来自耐盐基因的 SNP 的系统发育分析表明 IR29 与对盐胁迫高度敏感的 Plah Khaeng 密切相关（图 4b）。

（3）由于编码基因表达调节因子（如转录因子）的基因在盐胁迫反应和耐受性中起着至关重要的作用，我们考虑了来自该类别中 55 个基因的 230 个 SNP（补充表 S5）。参与基因调控的基因的 SNP 的系统发育分析表明，Lai Mahk 和 Luang Pratahn 密切相关，并与 IR29 共享一个共同的祖先（图 4c）。类似地，Pokkali 是一个外群，而其余的泰国水稻品种聚集成一个进化枝，包括耐盐和盐敏感品种。总之，这些结果表明 Lai Mahk 和 Luang Pratahn 在全外显子组和盐胁迫特异性基因水平上都存在密切的遗传关系。在耐盐基因方面，Lai Mahk/Luang Pratahn 谱系与 Jao Khao、Ma Gawk 和 Pokkali 谱系之间的距离表明，编码与耐盐性相关的基因表达调节因子的基因存在多样性。

(a) whole-genome single-nucleotide polymorphism (SNP), (b) SNPs from 164 salt-tolerant genes characterized in rice and other plants, and © SNPs from genes encoding transcription factors. The degree of salt tolerance is represented by color, from very tolerant (dark red) to sensitive (blue)

4.4 耐盐性品种的单倍型网络分析
为从基因型水平单倍型解析材料的遗传多样性，对每个基因进行了单倍型分析。
具有至少两个 SNP 的基因的单倍型被确定，产生 101 个基因。

特别的，OsHAK1（Os04g0401700）和OsNHX5（Os09g0286400）基因中单倍​​型数量最多（8个单倍型），而OsHKT8（Os01g0307500）和OsbHLH2（Os11g0523700）基因有7个单倍型。

耐受品种（Pokkali、Jao Khao、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Ma Gawk）共享 16 个基因的相同单倍型（补充表 S8），而敏感品种（Gam Feuang、KDML105、Mayom、Plah Khaeng 和 IR29） 26 个基因共享相同的单倍型（补充表 S9）。有 18 个基因的等位基因由耐性的泰国品种共享，但 Pokkali 不共享（补充表 S10）。

一些编码转录因子的基因显示出与耐盐性或盐敏感性相关的单倍型。耐病品种中具有相同单倍型的5个转录因子基因为OsWARK1、OsNF-YC1、OsbZIP23、OsMYB106和ONAC106，而在易感品种/系中具有相同单倍型的6个转录因子基因为OsDREB1B、OsDREB2A、OsHsfC1b、OsAP2- 125、OsSERF1 和 OsbZIP71。

（1）101 个基因的层次聚类分析将栽培品种/品系分为两大类：耐受型和敏感型（图 5a）。前四个耐受性品种 Pokkali、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Jao Khao 被归为一组。 Lai Mahk 和 Luang Pratahn 聚集在一个子集群中。三个敏感品种/品系 Plah Khaeng、KDML105 和 IR29 与 Ma Gawk 一起聚集在一起（图 5a）。

(a) Hierarchical clustering analysis of the Euclidian distances of all 101 salt tolerance genes. (b) Hierarchical clustering analysis of the Euclidian distances of the combination of 16 genes whose alleles were shared by tolerant cultivars and 26 genes whose alleles were shared by sensitive cultivars/line. The degree of salt tolerance is represented by color, from very tolerant (dark red) to sensitive (blue)

（2）耐盐基因的特定单倍型可以增强耐盐性
基于该分析，OsHAK1 和 OsNHX5 显示出最高的单倍型变异（图 6a）。 Pokkali、Jao Khao、Lai Mahk、Luang Pratahn 和 Ma Gawk 的 OsHAK1 中的 SNP 偏离其他盐敏感品种/系，导致不同的单倍型（图 6a）。还检测到 OsNHX5 单倍型的类似偏差（图6b）。在 Pokkali 和 Jao Khao 的 OsHAK20 中检测到许多 SNP（图 6c），这与这两个品种耐盐性特化的可能性一致。另一方面，IR29 和 Plah Khaeng 在 OsARP 中显示出独特的单倍型，编码液泡 Na+ 调节剂（图 6d）和 OsNHX1，编码 Na+/H+ 逆向转运蛋白（图 6e），这可能有助于这两个品种的盐胁迫敏感性/线。同样，盐敏感品种/品系，如 IR29、Plah Khaeng 和 Gam Feuang，表现出不同的转录因子基因单倍型，包括 OsWRKY1、OsNF-YC1、OsbZIP23、OsMYB106 和 ONAC106（图 7a-e）。

Haplotypes of the transporter genes (a) OsHAK1, (b) OsNHX5, © OsHAK20, (d) OsARP, and (e) OsNHX1 visualized by ‘PopART’. The red circles represent the tolerant cultivars, while the blue circles represent the sensitive cultivars/line. The size of the circle represents the number of cultivars having the same haplotypes. The ticks across the graph edges show the number of single-nucleotide polymorphisms between the connected circles

Haplotypes of the transcription factors genes (a) OsWRKY1, (b) OsNF-YC1, © OsbZIP23, (d) OsMYB106, and (e) OsNAC106 visualized by ‘PopART’. The red circles represent the tolerant cultivars, while the blue circles represent the sensitive cultivars/line. The size of the circle represents the number of cultivars having the same haplotypes. The ticks across the graph edges show the number of single-nucleotide polymorphisms between the connected circles

5. 讨论和总结

（1）在本研究中，使用从 10 个水稻品种/系的全外显子组序列获得的 SNP 进行系统发育分析（图 4a）。结果表明，8个泰国地方品种与Pokkali和IR29不同，表明这8个品种在进化上与Pokkali和IR29分离。这可以归因于 Pokkali 和 IR29 的不同地理起源；
（2）在本研究中，对 164 个耐盐基因的系统发育分析表明，在耐盐品种中控制耐盐性的基因存在遗传变异。需要进一步的研究来确定导致泰国水稻品种耐盐表型的基因；
（3）研究候选基因单倍型的共享，使用 R 包 GHap 进行了深入分析。由于地理起源的差异，泰国品种的耐盐胁迫很可能是独立于 Pokkali 培育的。

结论：
在本研究中，检测了 10 个水稻品种/品系，包括 8 个泰国当地品种和标准的耐盐 (Pokkali) 和易感 (IR29) 检查，以在幼苗期鉴定潜在的耐盐基因型。 四种泰国水稻品种，包括 Lai Mahk、Jao Khao、Luang Pratahn 和 Ma Gawk，表现出与 Pokkali 相似的耐盐胁迫水平。 Jao Khao 和 Ma Gawk 的耐受表型可能基于不同的基因和潜在机制。 这些耐盐品种的多样性可以提供遗传资源，可用于培育基础广泛且耐盐性强的新泰国品种。

思考

（1）表型调查方法和设计值得借鉴，表型数据分析具有代表性；
（2）单倍型网络分析能够一定程度鉴定耐盐性相关的基因；
（3）数据整合过程，文献筛选过程具有meta分析优势；

进化树分析内容部分感觉有些冗余，不同的SNP数据构建的进化树很可能不能有代表性的推断材料的关系，特别是本研究中基于gene和TF中的SNP数量较少。

单倍型网络部分分析值得探讨，之前没有相关的涉猎，需要再看一下。

参考文献：
https://acsess.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/tpg2.20189