凝胶电泳回顾

• 根据DNA marker看条带大小
• 看条带大小是否与目的条带的大小一致
• 看根据条带亮度推测DNA量
• 看PCR引物是否特异，即是否有杂带
• 看是否有引物二聚体判断引物的好坏

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• DNA凝胶电泳标准琼脂糖浓度一般为1.0%。浓度越高，小条带的分辨率越高；琼脂糖浓度越低，大分子量条带的分辨率和分离程度越高。
• 电场中，中性pH值缓冲液（TAE/TBE）下DNA带净负电荷并向凝胶装置正极(+)移动（下图中，上为“-极”至下为“+极”），DNA分子越大所受阻力越大，迁移越慢，500bp的DNA分子比200bp的DNA分子迁移慢。负电荷的磷酸集团。
• 电泳时需将DNA与荧光染料混匀，结合染料后，DNA在紫外灯下发出荧光，才会出现亮色条带，常用染料有EB（溴化乙啶）、gel red、sybrgreen1等（有钱建议不要用EB，有毒）。溴化乙锭等类似的核酸染料一定控制好用量（注意Gelred或者Gelgreen核酸染料更要控制用量，Gelred由两个溴化乙锭分子拼接，而Gelgreen由两个SYBR Green分子拼接，显色灵敏度或许更高，但嵌入核酸分子中后的阻力也更大），按说明书标准使用，切忌随意。
• 电泳结果解读，无法直接判断DNA长度，需要在电泳过程将DNA产物与DNA标准品（DNA Marker）一起电泳，DNA Marker里面含有若干种长度已知的DNA（下图中出现6条亮带的就是DNA Marker），与之比较可以粗略判断DNA样品的长度。DNA Marker中的DNA片段浓度已知，与DNA Marker的亮度比较初步判断DNA样品浓度。
• 结果解读：与DNA Marker比较，野生型是左边这个图，DNA片段长度大小约200bp，突变型是右边，突变有纯合突变和杂合突变，500bp的条带即纯合突变，最右200bp及500bp两条条带即为杂合突变。
  

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DNA电泳技术分离时影响其迁移速率的因素：

• DNA的分子大小
• 琼脂糖浓度
• DNA分子的构象。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而开环双链DNA移动最慢。
• 电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比
• 嵌入染料的存在。染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，使线状DNA迁移率降低15%。
• 离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率

分子生物学实验：https://max.book118.com/html/2016/0302/36634240.shtm