凝胶迁移（EMSA）实验详解

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什么是EMSA？

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凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

EMSA的原理

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EMSA技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后在跑PAGE胶，结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢，这样，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

如下图所示， DNA-复合物比非结合的探针移动得慢。

当检测DNA结合蛋白时，可用纯化的蛋白、部分纯化蛋白或核细胞抽提液；竞争实验中，采用含蛋白结合序列的DNA片段和寡核苷酸片段（特异）和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA结合蛋白的特异性；在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

EMSA的分类

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EMSA实验根据实验方案设计的不同，分为验证型EMSA、竞争型EMSA、超迁移EMSA。

3.1 验证型EMSA

用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。

探针与纯化蛋白混合孵育，探针与蛋白结合与否，可以直接表明探针和蛋白的互做关系。蛋白提取液中蛋白质混杂，种类不单一，探针可能与多种蛋白结合。因此，探针与蛋白提取液混合孵育，可以验证探针上是否含有蛋白结合位点，但是无法得知是何种蛋白与探针结合。

3.2 竞争型EMSA

与探针序列相同，不含修饰基团的DNA片段称为冷探针。

在探针与蛋白质混合液中加入大量冷探针，冷探针含有和探针相同的DNA序列，会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处，电泳带的的信号减弱或消失。

探针和蛋白的结合未必是特异性结合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验，可以排除假阳性结果，增加实验结果的准确性。

3.3 超迁移EMSA

超迁移EMSA利用到了与待检测的目的蛋白特异性结合的抗体。

如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白，无论是验证型EMSA，还是竞争型EMSA，都无法证明和探针结合的蛋白质就是我们所预期的。在实验体系中引入特异性抗体，用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物，这就是超迁移EMSA。

蛋白-探针复合物被抗体识别并结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。

超迁移EMSA是以竞争型EMSA为基础的实验方案。超迁移EMSA的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合，是否是特异性结合，与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。

所需材料

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4.1 实验材料：

DNA样品

4.2 试剂、试剂盒：

[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、