EMSA（电泳迁移率 shift 实验）是一种研究DNA结合蛋白与特定DNA序列相互作用的技术。原理基于DNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的不同迁移率。实验分为验证型、竞争型和超迁移型，用于定性和定量分析。通过标记、纯化、电泳和检测等步骤，EMSA可用于识别和验证蛋白质与DNA的特异性结合。
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什么是EMSA？
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凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
EMSA的原理
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EMSA技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后在跑PAGE胶，结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢，这样，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。
如下图所示， DNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
当检测DNA结合蛋白时，可用纯化的蛋白、部分纯化蛋白或核细胞抽提液；竞争实验中，采用含蛋白结合序列的DNA片段和寡核苷酸片段（特异）和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA结合蛋白的特异性；在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
EMSA的分类
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EMSA实验根据实验方案设计的不同，分为验证型EMSA、竞争型EMSA、超迁移EMSA。
3.1 验证型EMSA
用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。
探针与纯化蛋白混合孵育，探针与蛋白结合与否，可以直接表明探针和蛋白的互做关系。蛋白提取液中蛋白质混杂，种类不单一，探针可能与多种蛋白结合。因此，探针与蛋白提取液混合孵育，可以验证探针上是否含有蛋白结合位点，但是无法得知是何种蛋白与探针结合。
3.2 竞争型EMSA
与探针序列相同，不含修饰基团的DNA片段称为冷探针。
在探针与蛋白质混合液中加入大量冷探针，冷探针含有和探针相同的DNA序列，会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处，电泳带的的信号减弱或消失。
探针和蛋白的结合未必是特异性结合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验，可以排除假阳性结果，增加实验结果的准确性。
3.3 超迁移EMSA
超迁移EMSA利用到了与待检测的目的蛋白特异性结合的抗体。
如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白，无论是验证型EMSA，还是竞争型EMSA，都无法证明和探针结合的蛋白质就是我们所预期的。在实验体系中引入特异性抗体，用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物，这就是超迁移EMSA。
蛋白-探针复合物被抗体识别并结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。
超迁移EMSA是以竞争型EMSA为基础的实验方案。超迁移EMSA的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合，是否是特异性结合，与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。
所需材料
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4.1 实验材料：
DNA样品
4.2 试剂、试剂盒：
[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED(四甲基乙二胺)、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝。
4.3 仪器、耗材：
水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽
实验步骤
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5.1 探针的标记
5.1.1 如下设置探针标记的反应体系：
(1)待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。
(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
(3)Nuclease-Free Water ：5微升。
(4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
(5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。
(6)总体积 10微升
(7)按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
5.1.2 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
5.1.3 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
5.1.4 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
5.1.5 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
5.2 探针的纯化
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：
1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
3. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
4. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针好立即使用，长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
5.3 EMSA 胶的配制
5.3.1 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
5.3.2 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
(1)TBE buffer (10X)：1毫升。
(2)重蒸水 16.2毫升。
(3)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)：2毫升。
(4)80% 甘油：625微升。
(5)10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。
(6)TEMED ：10微升
5.3.3 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
5.4 EMSA结合反应
5.4.1 如下设置EMSA结合反应
阴性对照反应：
(1)Nuclease-Free Water ：7微升。
(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：0微升。
(4)标记好的探针 ：1微升。
(5)总体积 ：10微升。
样品反应：
(1)Nuclease-Free Water ：5微升。
(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。
(4)标记好的探针：1微升。
(5)总体积：10微升。
探针冷竞争反应：
(1)Nuclease-Free Water ：4微升。
(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
(4)未标记的探针：1微升。
(5)标记好的探针：1微升。
(6)总体积 ：10微升。
突变探针的冷竞争反应：
(1)Nuclease-Free Water ：4微升。
(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。
(4)未标记的突变探针：1微升。
(5)标记好的探针：1微升。
(6)体积 ：10微升
Super-shift反应：
(1)Nuclease-Free Water：4微升。
(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
(4)目的蛋白特异抗体 ：1微升。
(5)标记好的探针：1微升。
(6)总体积 ：10微升。
5.4.2 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
5.4.3 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。
注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
5.5 电泳分析
1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
5.6 转膜
a. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。
c. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
e. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。碧云天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 GS009 化学发光法EMSA试剂盒 3 / 5
f. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4C冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
g. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
5.7 交联
a. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒(根据经验，建议交联30min)。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
b. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。
c. 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
5.8 化学发光法检测生物素标记的探针
a. 37-50C水浴溶解封闭液和洗涤液。注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50C之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
b. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c. 取7.5l Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
d. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
i. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
k. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。
m. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
n. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
常见问题
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6.1 EMSA实验为何需要设置许多组对照实验？
EMSA实验会有如下对照组：
(1)阴性对照反应(标记探针)
目的：确定探针里面是否有杂质，光有探针，没有其他成分时，探针的位置，应该位于最下方。
(2)常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)
目的：看蛋白和探针是否结合。
(3)探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)。
目的：看探针结合的特异性。如果冷探针可以竞争结合，阻碍了标记的探针，说明2中的结合是特异的。
(4)突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)
目的：样本中没有可以与探针结合的蛋白。
(5)Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)
目的：判断蛋白的特异性，和抗体结合后，就会有super-shift。如果没有，说明是其他的蛋白结合。
6.2 看不到迁移带怎么办？
（1）标记的DNA探针量太少或者探针有降解
（2）某些蛋白和探针的结合条件比较特殊，需要优化结合体系
（3）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。
（4）样本中没有可以与探针结合的蛋白。
（5）探针与蛋白无特异性的相互作用。
（6）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。
（7）曝光或者成像时间过短。
6.3 实验背景为什么高？
（1）蛋白的质量不高，杂质多
（2）转膜时使用了Western Blot使用的工具，没有清洗干净
（3）TBE溶液中有悬浮物
（4）曝光或者成像时间过长。
（5）封闭时间不足或者效率不高。
（6）洗涤效果不佳。
（7）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。
6.4 Western Blot和EMSA有什么不同的意义？
Western Blot 只是反应表达分子含量，通过免疫性进行鉴定。
EMSA是蛋白分子与靶序列核酸的结合量，反应的是该分子的生物学活性。免疫性往往不能反应待测分子的生物学活性。转录因子EMSA最有说服力。
6.5 EMSA非放射性探针设计要注意哪些事项？
（1）防止错位配对、封闭成环，排除目标序列以外结合位点的
（2）防止产生空间位阻
（3）注意AT/GC比例
（4）EMSA探针不宜太长，一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难，还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。
（5）建议采用Biotin或红外荧光标记，尽量不要采用DIG标记。，探针两端都有标记以提高灵敏度
结果介绍
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第一泳道：只有特异结合的标记DNA，跑的最快；
第二泳道：在第一道基础上，加了核蛋白提取物，出现shift条带；
第三泳道：在第二道基础上，加入过量DNA（竞争冷探针），它抢走大量目标蛋白，由于没带标记，shift条带变淡，甚至消失；
第四泳道：加入无关未标记探针，不结合核蛋白抽提物，结合条带再次出现。
参考文献
8
《现代生命科学研究技术》
赛思基因（www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。
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