DNA电泳条带的灰度分析

有时候需利用电泳后胶图定量DNA的浓度和含量，这里需要对图像中的条带作灰度分析。灰度是图像中每个像素的亮度信息。这里结合我自己使用imageJ分析灰度的经验，总结下大概流程和小贴士。

分析灰度的两种方法：

法1 mageJ打开胶图>Image>Type>8-bit,Edit > Invert>Process>Substract Background, Analyze>set scale>转换为pixel，>Set measurements>选中IntDen，Area,Mean gray value>框选条带ctrl+m测定>测空白处>空白处积分密度-条带积分密度

图解：

1.图片处理：

Image>Type>转换为8-bit,

Analyze>set scale>将单位转换为pixel

黑白反转，去背景：

2.测量：

Analyze>set measurements处设置需要测的参数，这里选了面积、平均灰度和积分密度

选择工具：

个人选用的是方框，有朋友反应她用椭圆工具比较好用。我这里因为后面设定了ROI，所以方框用起来也很方便

框选了marker条带，打开Analyze>Tools>ROI manager（选区管理器），弹出来一个小弹窗管理器，点击add将这个框添加到管理器中，以后如果不小心丢失了选框，只要在管理器中点击这个框的名称，就会在这个框选定的地方重新出现你的方框，再也不用担心测量多个条带时选框丢掉

（图中选区有设置第一道，也就是框中间那个序号1，在这个方法中不需要）

接下来，就可以ctrl+M或者英文输入法下单击M愉快地测定啦

在测定时，框的面积保持一致。在使用鼠标时，如果光标在框内是箭头，就是可以移动方框且不变形，若光标是手指，方框会变形

当然，选择方框，然后键盘上下左右键平移，也非常丝滑~

在测完条带后，不要忘了选一处背景，测一下

得到结果后，看RawIntDen,用空白处的减去其他条带的，得到结果与DNA浓度成比例。假如知道一条的浓度和灰度结果，就可以对其他条带进行定量

如已知这个marker最上面一条是10ng/uL，也就是其他条带浓度可以根据比例计算：

                 （S1）

 

Fin

 

法2 个人觉得比较适合高通量工作：

mageJ打开胶图>Image>Type>8-bit,Edit > Invert,Process>Substract Background, Analyze>set scale>转换为pixel，框选空白区>ctrl+1选定>ctrl+c +v复制空白到与条带同高度的marker处，遮挡下杂乱的带，后同样选区选定可以分清的一条marker，复制到与待测条带一样水平处。

框选一行条带，带上空白>Crtl+1>ctrl+3，直线工具划分峰图，魔棒点击计算面积>测试条带的积分-空白处的积分（area）

大概是通过图像中像素灰度计算积分，下面是操作：

转换为8-bit类型，黑白反转，消除背景，设置长度单位的工作相同，

后面我需要把marker条带抠到和其他条带同一水平，因为我的ladder比较杂乱，所以我先抠了一块背景遮一下没有用到的ladder

框选一片背景，

ctrl+1或者Analyze>Gels>Select First Lane,选择选区

选中的区域可以ctrl+C,ctrl+V,在选框原位被复制，只要把它拉到该去的地方就好了

→

同样操作，选区，复制，将顶上分离的marker复制到和其他条带一个水平

开始测量：

框选要测的条带：

我这里后面多选了是为了测背景。ctrl+1选择第一道，然后ctrl+3或Analyze>Gels>Plot Lane，调出这一泳道的图像

用直线工具划分每个独立的峰：

选择魔棒工具，单击每一个峰，出来一个弹窗是峰下面积

条带峰下面积减去空白处的峰下面积，得到灰度结果，用S1计算待测条带DNA浓度

Fin

法1和法2计算出来的结果相关性好，两种方式都可以用来定量DNA

 

其他小Tips：假如使用的核酸染料带电荷，比如带正电，在电泳过程中染料也会迁移。所以如果使用大胶，要注意各层的核酸染料不一样，得到的条带亮度不一样，所以每一层条带只能和本层的marker比较、定量。所以跑胶时每一行都放一个marker。

如有纰漏，敬请指正