16S扩增子Qiime2。从fq，fastqc等格式文件到OTU table（更详细）

平台：Ubuntu Linux平台上进行。

在进行16S扩增子实验前，我们需要安装好fastqc，相关教程在我的其他文档，如：在Linux中的qiime2。安装一天的fastqc，找到最好的解决办法-CSDN博客

一、文件要求：1、fq，fastqc等格式。

2、mapping.txt。linux中的示例：

3、manifest.txt，linux中示例：

 以上文件存放在同一个文件夹里并命名为dna_data.

二、1、激活qiime2。conda activate qiime2-amplicon-2023.9#(qiime2-amplicon-2023.9为你下的版本)

2、在qiime2的根目录中开始进行命令操作。

3、 输入文件 user@user:~$ qiime tools import \
--type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
--input-path /home/user/dna_data/manifest.txt \
--output-path result/paired-end-demux.qza \
--input-format PairedEndFastqManifestPhred33

(/home/user/dna_data/manifest.txt  绝对路径可以防止报错，下文输入的路径全是绝对路径)
成功标志：Imported /home/user/dna_data/manifest.txt as PairedEndFastqManifestPhred33 to result/paired-end-demux.qza

三、以下操作都在cd result的文件下进行操作

1、 去除引物序列(本人的数据不知道引物序列，因此没做)

引用原话：

本测序数据的引物为338F和806R， p-front-f和p-front-r处分别输入自己的F和R端引物序列。

nohup time qiime cutadapt trim-paired \
--i-demultiplexed-sequences paired-end-demux.qza \
--p-front-f ACTCCTACGGGAGGCAGCA \
--p-front-r GGACTACHVGGGTWTCTAAT \
--o-trimmed-sequences paired-demux.qza

2、创建可视化文件查看数据

user@user:~/result$ qiime demux summarize \
--i-data paired-end-demux.qza \
--o-visualization demux.qzv
成功标志：Saved Visualization to: demux.qza.qzv

3、data2降噪、序列质量控制、构建特征表和代表序列表

 人家老大哥原话，更好理解：在qiime2网站中查看上一步得到的paired-demux.qzv，得到碱基质量值下降位点，使用p-trunc-len-f和p-trunc-len-f切除质量差的碱基。

user@user:~/result$ time qiime dada2 denoise-paired \
--i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza \
--p-trunc-len-f 228 \
--p-trunc-len-r 215 \
--o-table table.qza \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-denoising-stats denoising-stats.qza
成功标志：Saved FeatureTable[Frequency] to: table.qza
Saved FeatureData[Sequence] to: rep-seqs.qza
Saved SampleData[DADA2Stats] to: denoising-stats.qza

4、查看去噪过程统计

user@user:~/result$ qiime metadata tabulate \
 --m-input-file denoising-stats.qza \
 --o-visualization denoising-stats.qzv
成功标志：Saved Visualization to: denoising-stats.qzv

5、查看统计特征表

user@user:~/result$ qiime feature-table summarize \
 --i-table table.qza \
 --o-visualization table.qzv \
 --m-sample-metadata-file /home/user/dna_data/mapping.txt

(/home/user/dna_data/mapping.txt。绝对路径)
成功标志：Saved Visualization to: table.qz

6、①.导出feature table

user@user:~/result$ qiime tools export  --input-path table.qza  \
--output-path feature_table
成功标志：Exported table.qza as BIOMV210DirFmt to directory feature_table

user@user:~/result$ biom convert -i feature_table/feature-table.biom  \
-o feature_table/feature-table.txt  --to-tsv

示例：

②. 计算relative frequency,并导出feature table

相关性： ser@user:~/result$ qiime feature-table relative-frequency --i-table table.qza \
--o-relative-frequency-table table-relative.qza
成功标志：Saved FeatureTable[RelativeFrequency] to: table-relative.qza

导出feature table：user@user:~/result$  qiime tools export  --input-path table-relative.qza  \
--output-path feature_table_relative
成功标志：Exported table-relative.qza as BIOMV210DirFmt to directory feature_table_relative

 user@user:~/result$ biom convert -i feature_table_relative/feature-table.biom  \
-o feature_table_relative/feature-table_relative.txt  --to-tsv

示例：

 为了以防以后忘记物种注释，本人将前人的记录摘抄下来，如下：

下载已建好的silva分类器：

由于训练Silva分类器需要花费大量时间，而Qiime2官网有已训练好的分类器，我们就用现成的了。本文使用的分类器为Silva 138按99%相似度聚类OTUs的全长序列。如果测序数据的引物序列为515F和806R，可以选择Silva 138按99% OTUs聚类V4区515F/806R的序列。

wget -c https://data.qiime2.org/2023.9/common/silva-138-99-nb-classifier.qza

生成物种注释表

nohup time qiime feature-classifier classify-sklearn \
 --i-classifier silva-138-99-nb-classifier.qza \
 --i-reads rep-seqs.qza \
 --o-classification taxonomy.qza &

可视化物种注释表

time qiime metadata tabulate \
 --m-input-file taxonomy.qza \
 --o-visualization taxonomy.qzv

 参考链接：1、Qiime2分析16S扩增子：从conda环境配置到生成OTU表 - 知乎 (zhihu.com)

                   2、3-下机数据的标准化处理（上）_哔哩哔哩_bilibili