如何对利用GWAS关联到的SNP位点进行注释

生信学习小达人

于 2024-08-29 12:27:41 发布

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分类专栏：分析文章标签：学习方法

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GWAS（全基因组关联研究）关联到的SNP（单核苷酸多态性）位点注释是一个复杂的过程，涉及多个步骤，旨在理解这些位点在基因组中的生物学意义。

1.对SNP位点进行注释

涉及的一般步骤：

确定SNP位点：
从GWAS分析中获取与疾病或性状显著相关的SNP位点列表，包括它们的染色体位置和关联统计数据。
使用专业数据库：
利用如dbSNP、1000 Genomes Project、gnomAD等公共数据库查询SNP的基本信息，包括等位基因频率、基因型数据等。
预测SNP的功能影响：
使用如SIFT、PolyPhen-2、CADD等工具预测SNP的生物学功能，判断它们是位于编码区、非编码区，还是调控区域。
基因定位：
确定SNP位点所在的基因或基因附近区域，分析它们是否在基因的编码区、内含子、启动子或调控元件中。
检查基因-基因和基因-环境交互作用：
分析SNP位点是否与其他遗传变异或环境因素有交互作用。
通路分析：
使用如KEGG、Reactome等数据库进行通路分析，查看SNP位点所在的基因是否参与特定的生物学通路。
转录因子结合位点分析：
检查SNP位点是否位于转录因子的结合位点，可能影响基因的表达调控。
表观遗传学分析：
考虑SNP位点是否涉及DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学变化。
文献检索：
通过PubMed、Google Scholar等数据库检索与SNP位点相关的文献，了解先前的研究成果和理论。
使用注释工具和软件：
利用如ANNOVAR、SNPnexus、HaploReg等专门的SNP注释工具进行综合注释。
数据可视化：
使用IGV、UCSC Genome Browser等工具将SNP位点映射到人类基因组上，进行可视化分析。
综合分析：
将上述所有信息综合起来，形成对SNP位点的全面理解，包括它们可能的生物学功能和在疾病发生中的作用。

2.确定哪些SNP位点与疾病关联性最强

数据质量控制：在进行GWAS之前，需要进行数据的质量控制，包括缺失数据的处理、性别不一致性检查、小等位基因频率（MAF）筛选、Hardy-Weinberg平衡检验等，以确保数据的准确性和可靠性。
统计分析：使用统计方法比较病例组和对照组中每个SNP位点的等位基因频率差异。常用的统计检验包括卡方检验、T检验或线性回归模型等。
关联强度评估：计算每个SNP位点的关联P值，P值越小，表明SNP位点与疾病关联的证据越强。通常，会设定一个阈值（如P<5×10^-8）来确定显著性关联位点。
曼哈顿图和QQ图：通过曼哈顿图可视化SNP位点的P值分布，以及使用QQ图评估观察到的P值分布是否符合预期的均匀分布，从而评估整体的GWAS分析结果。
多重检验校正：由于GWAS涉及的检验次数众多，需要进行多重检验校正，如使用Bonferroni校正或False Discovery Rate (FDR)方法，以减少假阳性结果。
生物信息学分析：对显著关联的SNP位点进行生物信息学分析，包括功能注释、通路分析、基因本体（GO）分析等，以探究其生物学意义和潜在的疾病机制。
独立样本验证：为了验证GWAS分析中发现的显著关联位点，通常需要在独立的样本中进行复制研究，以确认其与疾病的关联性。
综合分析：结合多个GWAS研究结果，使用元分析（meta-analysis）方法来提高统计功效，识别跨研究一致性高的关联位点。

3.利用生物信息学工具来预测SNP位点的生物学功能

利用专业数据库和网站：使用如GWAS4D、3dsnp、iRegNet3D、FUMA GWAS Catalog等在线资源和工具，这些工具提供了SNP位点的功能注释、相关疾病、基因本体（GO）分析等功能。
功能注释方法：对SNP位点进行详细表征，包括它们在染色质活性区域的富集情况、与转录因子结合区域的关系、以及它们对基因表达调控的潜在影响。
基于序列特征和结构特征的预测：对于错义SNP，使用基于序列特征（如SIFT、PolyPhen-2）和基于结构特征的方法来预测其对蛋白质功能的影响。
高通量实验方法：例如STARR-seq，这是一种用于鉴定具有调控基因表达功能的SNP的方法，通过比较含有SNP两种基因型的片段活性差异来识别调控型SNP 。
后GWAS分析：使用如CADD、RegulomeDB等工具，这些工具可以提供SNP的保守性得分、eQTLs、染色质交互作用等信息，帮助理解SNP的生物学功能。
基因组预测方法：结合基因组预测方法，如正则化线性回归、基因组选择方法和机器学习方法，这些方法可以帮助解释更多的遗传方差，并预测个体的表型。
使用特定软件：例如SNPFlip，这是一个开源工具，可以快速准确地识别DNA序列中的SNP，并进行反向互补配对以确保分析的一致性。

4.评估预测出的SNP位点对基因表达的调控作用

使用生物信息学工具进行功能注释：可以利用如snpEFF、Annovar等工具对SNP位点进行注释，以确定每个SNP的变异类型和影响区域。
识别eQTL位点：如果一个SNP对基因的表达产生了影响，这个SNP可以称为eQTL位点（expression Quantitative Trait Loci）。可以通过提取样本的RNA进行qRT-PCR得到候选基因的表达量作为表型，结合SNP集作为基因型进行GWAS分析，以识别显著的SNP位点。
区分cis-eQTL和trans-eQTL：如果显著的SNP位点位于候选基因周围的调控区域，则为cis-eQTL；如果不在候选基因周围的调控区域，需要进一步研究其对候选基因的作用，如果成立，则为trans-eQTL。通常，顺式eQTL的数量要多于反式eQTL 。
利用CRISPR衍生的合成生物学工具：CRISPRi和CRISPRa技术可以用来评估SNP位点对基因表达的影响。CRISPRi可以抑制基因表达，而CRISPRa可以激活基因表达，通过这些工具可以研究特定SNP位点的功能。
结合多组学数据和模型：将组学数据与CRISPRi结合使用，可以实现途径的过渡性调节，以增加某种化合物的产量或研究通量。例如，结合蛋白质组分析和选择性基因沉默，可以揭示可以抑制以重定向糖代谢至生产特定化合物的基因。
进行实验验证：使用如ChIP-seq等实验技术对预测的调控型SNP进行验证，研究其对基因表达调控的影响，以及它们在不同细胞类型中的作用。
分析SNP位点与其他表型的互作：重新分析meQTL中SNP与CpG位点的关系，寻找与白细胞组成、BMI或吸烟之间相互作用的证据，这些特征此前被报道与DNA甲基化有很强的关联。

5.确定SNP位点与特定表型的关联性

样本收集与表型定义：
收集足够数量的样本，并明确定义研究的表型，包括疾病的诊断标准或量化的性状。
基因型分型：
使用高通量技术对所有样本进行基因型分型，以获得大量的SNP位点数据。
数据质量控制：
对基因型数据进行质量控制，包括过滤掉低频的SNP、去除缺失数据多的样本、检查性别不一致性、进行Hardy-Weinberg平衡检验等。
统计分析：
利用统计方法比较不同表型组之间的SNP位点频率差异。常用的统计检验包括卡方检验、T检验或回归分析等。
计算P值：
对每个SNP位点计算与表型关联的P值，评估其与表型的关联强度。
多重检验校正：
由于GWAS涉及的检验数目巨大，需要进行多重检验校正，如使用Bonferroni校正或False Discovery Rate (FDR)方法。
确定显著性阈值：
根据多重检验校正的结果，设定显著性阈值（如P<5×10^-8），确定与表型显著关联的SNP位点。
曼哈顿图和QQ图分析：
使用曼哈顿图可视化所有SNP位点的P值分布，QQ图评估观察到的P值是否符合预期的均匀分布（选择合适的关联模型：一般线性模型GLM,混合线性模型MLM，多位点混合模型MMLM，Fast-LMM）。
生物信息学分析：
对显著关联的SNP位点进行生物信息学分析，包括功能注释、通路分析、基因本体（GO）分析等。
独立样本验证：
在独立的样本集上验证GWAS分析中发现的显著关联位点，以确认其与表型的关联性。
元分析：
结合多个GWAS研究结果，使用元分析方法来提高统计功效，识别跨研究一致性高的关联位点。
综合评估：
综合考虑统计显著性、生物学意义、以及与已知文献和数据库信息的一致性，评估SNP位点与特定表型的关联性。