NGS建库为何需要PCR，何时需要去重？

背景

二代测序建库时，当连接好接头之后，需要进行PCR，而目的是什么？对后续生信分析有何影响？

为什么需要PCR？

一般是因为DNA浓度过低，取样上机时只有很少一部分DNA被捕获到，导致基因组很多区域没有测到。这也是DNA输入量影响覆盖度的重要原因之一。

而不足的原因就有很多了，比如本身input量就很低（cfDNA、FFPE及其他低DNA含量组织），或者是本来DNA量是够的，但是在处理过程中（比如超声波打断、酶切、重亚硫酸氢盐转换等）DNA发生了部分降解，导致一些片段丰度降低。同样不能被 flowcell 上的接头捕获。

所以，那些低丰度的DNA分子在扩增之后多少就能够被捕获到了，以提高覆盖度。

但是PCR步骤也会带来一些问题。

为什么需要去重？

理想情况下，不管P不PCR，这些片段被捕获的概率相同，但是PCR存在着偏好性，即不同的DNA分子被扩增的次数不尽相同，片段长度、GC含量都会有影响。

因此，对于随机打断的建库方式来说（比如WGBS、ATAC-seq、ChIP-seq），如果后续比对后发现reads的起始、终止及之间的序列完全相同，则为PCR产生的duplicate，如果不去重的话，则直接影响到丰度和最终的读值。

而对于本身或建库过程中就会产生大量重复序列的建库方式来说（比如RNA-seq、RRBS、TBS），这些duplicate本身就是存在的有意义的，而不是无效拷贝，因此必须保留。

去重的工具

直接去除

• samtools rmdup
• sambamba markdup -r

只标记不去除

• sambamba markdup
• picard MarkDuplicates

在需要时再去除，比如WGBS数据的分析，在提取甲基化读值的步骤MethylDackel extract时，则自动不提取标记为重复的reads