基因测序1 - PCR扩增与PCR-free建库

1. PCR扩增简介

高通量测序中，常规的文库构建需要PCR扩增，一方面，是为了对微量DNA样本进行扩增，提高文库产量，另一方面，可以放大荧光信号，让测序仪更容易捕获和识别荧光信号，提高测序准确度。但是，PCR就像一把“双刃剑”，在解决了样本起始量低的问题并起到放大荧光信号作用的同时，也引入了扩增错误和偏向性。

2. PCR扩增目的

通过放大DNA荧光信号，方便相机更容易捕获和识别荧光信号，提高信噪比（Signal-to-Noise Ratio：SNR），信噪比越高，表示信号相对于噪声更强，质量更好，准确度更高。

3. PCR扩增引入测序错误

碱基错配

PCR聚合酶有一定的比例会引入碱基错配，通过PCR扩增，引入的错误会累积下来，造成假阳性的变异，难以区分和识别。

扩增偏好性

PCR聚合酶有一定的扩增偏好性，尤其是高GC或者低GC、二级结构等区域扩增效率低，降低基因组覆盖度。即模板的二级结构复杂或热稳定性不好，都会影响PCR扩增效率； 某个基因组富含AT或GC，则序列覆盖中的偏向会在PCR扩增过程中增加。在PCR扩增的过程中，高GC的模板难以完全变性，即使变性，当退火步骤温度降低时，这些链也可能形成很强的分子内氢键，从而使聚合酶难以发挥作用。

引入Indel错误

引入Indel 插入缺失错误，导致Indel检测错误率增加。

产生大量的Duplication

造成大量数据浪费，在比对后通常会去除Duplication reads。

4. PCR-free建库

PCR-Free建库技术的引入，克服了PCR的缺点。

PCR-free建库是指文库的准备截止在接头连接磁珠纯化后，不需要PCR扩增的建库过程。即在建库到测序全流程均无文库扩增的过程或者无PCR扩增错误积累的测序技术，在NIPT、NIPT-PLUS和CNV-seq等检测项目中能有助于临床完成精准的检测，避免由PCR扩增引入的错误，但需要较大起始DNA投入量。

通常来讲，一些具有复杂的二级结构、高GC、存在PCR偏好性的特殊样本可选择构建PCR-free建库策略。

5. PCR-free建库流程

1. 样本检测
2. DNA片段化
3. 末端修复+加A接头
4. 片段分选
5. 文库质控
6. 上机测序

6. PCR-free建库优势

1. 文库真实性高
2. 无PCR扩增偏好，有良好的文库覆盖度和均一性； 无Duplicate reads，避免数据浪费
3. 简化测序流程，节约实验时间； 省去PCR扩增步骤，减少试剂投入