生物信息学测序之常见测序方法DNA文库构建

1. 第三代测序

检测样品要求：

• 纯度：DNA纯度较高，无RNA、蛋白质污染
• 浓度：大于等于30ng/uL
• 完整性：无降解
• 样品量：大于等于5ug

 

2. Hiseq小片段文库建库

样品处理建库过程：打断——>接头——>扩增

2.1 打断

打断方式：超声波、雾化、物理方式

2.2 接头

末端修复的三种酶：T4 DNA聚合酶、T4 PNK、Klenow DNA聚合酶

 

Klenow DNA聚合酶 3'端加A，为了方便连接接头，即A-T连接。

加接头：T4连接酶

Hiseq接头为Y型接头。

2.3 PCR扩增

使用P5、P7引物

片段选择：采用２％凝胶电泳分离——＞质控出库——＞上机测序

 

3. Hiseq大片段文库建库

过程：

样品——>打断——>末端加生物素——>环化——>打断

其中1个片段有生物素——>磁珠筛选生物素片段——>加接头——>PCR——>建库

过夜电泳，消化线性DNA，磁珠分离

 

4. 454文库构建

过程：

样品——>打断——>末端修复——>加A——>接头——>PCR

PCR过程属于乳化PCR，即文库种到芯片上，因此每个油珠只有一种PCR片段产物。

 

5. complete genomics(CG)

CG已被华大基因收购。

建库过程类似于Hiseq小片段建库过程，但芯片不同于Hiseq。