AI结构预测的边界：AlphaFold为何不能取代实验结构生物学

最新推荐文章于 2025-05-08 09:45:00 发布

小马不会过河

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人工智能的飞速发展为生物学研究带来了深远影响，其中，AlphaFold2在蛋白质结构预测领域引发了革命性的突破。本文评估了AlphaFold2对GPCR结构预测的可靠性，发现其虽能准确捕捉GPCR整体骨架的主要特征，但在胞外域与跨膜域的组装、配体结合口袋的形状以及信号传导界面的构象等方面，与实验解析的高分辨率结构存在显著差异。这些差异限制了其在GPCR功能研究和基于结构的药物设计中的应用能力。因此，AI结构预测尚不能完全取代实验结构生物学，需要联合使用以辅助药理学研究和药物设计。

1 AlphaFold与结构生物学

近年来，人工智能（artificial intelligence，AI）以惊人的速度发展，改变了我们生活和科学研究的许多方面。2024年诺贝尔物理学奖和化学奖双双花落“AI”领域，物理学奖突出“科学如何应用于AI，改变AI”，而化学奖突出“AI如何改变科学和人们的认知”。本文将探讨获得2024年诺贝尔化学奖的蛋白质结构预测工具AlphaFold和传统的结构生物学方法的对比。

AlphaFold是由DeepMind开发的AI模型，能够根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维结构。蛋白质就像是生命体内的小机器，它们的结构决定了功能。了解蛋白质的结构对于药物研发和理解生命过程非常重要。AlphaFold的出现，让人们看到了快速预测蛋白质结构的可能性。

截至目前，AlphaFold的3个主要版本分别是AlphaFold1、AlphaFold2和AlphaFold3，各自代表了从基础探索，到高精度预测和复合体建模的逐步演进（表1）。

表1 3代AlphaFold的核心差异对比

传统上，结构生物学使用实验手段来解析蛋白质的三维结构，主要的方法有以下几种：

X射线晶体学：是最早且最常用的方法。研究者需要首先让蛋白质形成晶体，然后用X射线照射这些晶体，得到衍射图样。通过解析这些图样计算出蛋白质的三维结构。但这一过程非常复杂，需要大量的时间和精力，尤其是培养出合适的蛋白质晶体并不容易，并且某些蛋白质无法在任何条件下结晶，这限制了晶体学对蛋白结构的研究。
核磁共振（NMR）：这种方法利用了原子核在磁场中的特性。研究者将蛋白质溶解在溶液中，放入强大的磁场中，然后测量原子核的信号。通过这些信号，可以推断出蛋白质的结构和动态信息。但NMR适用于研究小型蛋白质，对于分子量较大的蛋白复合体并不适用。
冷冻电子显微学（Cryo-EM）：这是近年来迅速发展的技术，将蛋白质快速冷冻保持天然状态，在电子显微镜下观察。总体上精度不如晶体学研究，仅部分结构达到近原子分辨率。适合研究大型蛋白质复合物，不过设备昂贵，操作要求高。

这些传统方法虽精确可靠，但过程繁琐、耗时耗力，需要丰富经验和技术支持。AlphaFold出现后，有人思考传统实验方法是否还有必要。实际上，AlphaFold存在局限性，如对蛋白质动态变化预测能力有限，预测复合物结构仍面临挑战，其预测结果常需实验确认。

笔者对比了AlphaFold预测的G蛋白偶联受体（GPCR）结构与实验解析结果，发现AI预测虽有一定准确性，但关键细节存在差异，会影响药物设计和功能研究。AlphaFold是重要工具，但不能完全取代传统结构生物学方法，实验验证依旧是理解生命奥秘的关键。

2 GPCR的奥秘与AlphaFold2

GPCR，是一种通过G蛋白传导信号的受体，广泛表达于细胞膜表面，负责将胞外信号传递到细胞内部。人类能看到东西、闻到味道，甚至感受到情绪波动，如开心和难过，GPCR都在其中扮演着关键角色。正因如此，它成为了现代药物设计中最重要的靶点之一，食品药品监督管理局（FDA）批准药物中约有三分之一都作用于GPCR，其年销售额甚至超过1万亿美元。

尽管GPCR的重要性不言而喻，但由于其高度复杂的结构和在激活时产生的显著动态变化（图1），解析GPCR的高分辨率结构一直是生物学上的重大挑战。传统的X射线晶体学技术和近年来兴起的Cryo-EM技术虽然取得了一些突破，但获得高分辨率的GPCR结构仍然是一个耗时且成本高昂的过程。这一技术瓶颈限制了我们对GPCR功能的深入理解，也在新药开发中形成了障碍。

图1 GPCR的激活机制，红圈表示激活过程中发生主要变化的跨膜螺旋6

AlphaFold2为GPCR结构预测带来突破，在蛋白质结构预测竞赛中表现出色，预测效果接近实验精度，为GPCR相关研究提供了有力工具。但它在取代传统结构生物学方法方面仍存在局限。本文选取了AlphaFold2发表后的29个GPCR结构，使用AlphaFold2折叠了它们的预测模型，并进行了和实验结构的比较和评测。由于这些蛋白不在训练集中，这排除了AlphaFold2预测时参考训练集数据的可能。

3 整体结构区别：AlpahFold2是个好导航，但可以更好

在细胞生物学的世界里，蛋白质就像一台复杂的机器，GPCR则像传递外界信号的特工，AlphaFold2则是高科技的导航系统，能够预测这些特工的“路线”。GPCR由7段跨膜螺旋组成，AlphaFold2在捕捉其整体布局上表现不错，评测的蛋白整体均方根偏差（RMSD）为1.64Å，体现出较高精确度。

不过，当GPCR带上大型细胞外结构（ECD）时，AlphaFold2的预测误差通常会增大。因为ECD和跨膜区域（TMD）之间的相对位置预测不够准确，如结合了semaglutide的胰高血糖素样肽-1受体（GLP1R），整体误差达3.92Å。在甲状旁腺激素2受体（PTH2R）和激活态的黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）中，也出现整体RMSD大于分开计算的RMSD的情况。对于在训练集中不常见的失活态LHCGR，整体RMSD竟然达到了6.08Å，差异极大（见图2）。

图2 具有大型胞外结构域的预测模型和实际结构对比，提供了分开对齐和整体对齐的RMSD

4 关键药物作用位点：AlphaFold2无法指引重要路口的方向

GPCR类似繁忙的城市中心，小分子药物像寻找关键交汇点（正构位点）的游客。准确了解正构位点结构对基于结构的药物设计和功能研究至关重要。

本文评估的29个GPCR结构中有4个是与小分子配体结合的受体。结果显示，AlphaFold2预测的GPCR主链结构与实验数据相似（平均主链RMSD仅为0.89Å），但关键残基侧链差异显著，侧链RMSD高达1.90Å，整体原子RMSD为1.52Å。使用基于AlphaFold2预测结构的分子对接评估发现，大部分对接不能重现结果（见图3）。

图3 AlphaFold2预测模型和电镜结构在小分子配体口袋上的对比

例如在5-羟色胺1F受体（5HT1FR）案例中，AlphaFold2预测的侧链排列出现偏差，阻碍了三氟苯环与H176ECL2的相互作用，导致分子对接生成的小分子结合姿态与实验结构差异大，RMSD达到7.15Å。在褪黑素受体1A（MT1R）案例中，F1965.47侧链向外“偏航”，导致对接后的小分子朝着TM螺旋束中心移动，RMSD为4.79Å。在LHCGR案例中，F515ECL2侧链改变了顶部“交叉口”环境，小分子配体无法成功被对接。虽然在2型辅助T细胞上表达的趋化受体同源分子（CRTH2）案例中，预测模型与实验结构在正构位点高度一致，对接结果也几乎完全吻合，但这种理想情况并非普遍存在。

5 TM6-TM7：复杂多变的导航路线，AlphaFold2往往难以把握

在GPCR的世界中，TM6和TM7这2段跨膜螺旋就像是细胞信号传递中的关键“交通枢纽”，会根据需要进行动态调整，为重要的下游信号分子（如G蛋白等）提供畅通的“通行路径”。然而，实验结构和预测模型在这些关键“路段”上往往存在显著差异，AlphaFold2在预测这些变化时也确实面临挑战，相关结果在图4中展示。

图4 AlphaFold2预测模型和电镜结构在胞外关键激活螺旋上的对比

研究发现，有些GPCR在预测模型中的TM6-TM7构象与实验结果有较大出入，误差超过了2Å。例如，在ghrelin受体和抗利尿激素受体（V2R）的“地图”中，这些关键“路段”的偏差分别达到了3.08Å和2.83Å。在GLP1R和PTH2R的模型中，TM6和TM7被预测为“向上抬升”，影响小分子无法正确“到达”结合位点。

同样地，细胞内区域的情况也值得关注（图5）。通过测量TM6的开启程度，我们可以了解这些GPCR在细胞内侧为蛋白结合伙伴预留的“通行空间”有多大。有趣的是，不同类型的GPCR在预测模型中预留的“空间”差异明显。对于没有结合G蛋白的A类GPCR，预测结构中预留的“空间”比实验结构更多。而对于已经结合了G蛋白的A类GPCR，预测结构中预留的“空间”却更少。B1类GPCR的预测模型与实验结构几乎一致，可能是训练数据中激活态B类GPCR结构较多。此外，某些A类GPCR的胞内环区3（ICL3）在预测模型中与实验结构差异大，如5HT1FR和胆囊收缩素受体1（CCKAR）。

图5 AlphaFold2预测模型和电镜结构在胞内关键激活螺旋（TM6）上的对比

6 蛋白结构预测的误差：为什么AlphaFold2有时会“迷路”？

AlphaFold2预测GPCR结构时，在某些关键区域会出现误差。如在GLP1R案例中，预测的ECD-TMD结构阻碍了肽的结合，可能是训练过程中缺乏配体信息，无法准确重现有利于肽结合的特定ECD-TMD构象。

预测与小分子结合的GPCR结构时，虽主链预测准确度约1Å左右，但预测与配体相互作用的“结合口袋”结构时仍面临挑战。更糟糕的是，在LHCGR案例中，预测模型甚至未形成适合小分子对接的“停靠点”。

对于TM6螺旋的预测，AlphaFold2似乎倾向于产生一种介于激活态和非激活态之间的“平均”构象。此外，ICL3区域的预测也常常出现过长的螺旋结构，而在实验结构中，这些区域通常是灵活多变的。这可能是因为AlphaFold2从包含骨限制性干扰素诱导跨膜蛋白样（BRIL）融合蛋白的非天然GPCR结构中学习，导致了偏差。

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