从PCR到qPCR——关于理论、应用的演化简史

自1985年PCR作为一种专利所属的生物技术登上分子生物学的舞台以来，迄今还没有哪一种生物技术对整个生命科学的发展产生如此深刻的影响，引用论文之多、应用范围之广。PCR以其高灵敏度、高效率扩增目的DNA的特点，广泛应用于生命科学、医疗诊断、法医检测、食品卫生和环境检测等方面。

　　PCR (Polymerase Chain Reaction) 翻译成中文的全称是“聚合酶链式反应”，简单来说，在两个短核苷酸 (引物) 和耐热的DNA聚合酶的作用下，首先将待扩增DNA模板加热变性解链，之后冷却至某一温度时，引物与待扩增DNA单链接合，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种变性－退火－延伸的过程就是一个PCR循环，不断重复，短短数十分钟就可对DNA模板进行2n倍扩增。整个反应流程大致如下：

PCR反应中所需的基本试剂组成包括：

1.DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片段。

2.一对引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。

3.DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。

4.脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。

5.含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

而现在成熟PCR试剂（StarLighter 热启动 Taq Pro PCR预混液，FS-P5001）中，往往已将除引物和模板之外的反应试剂按照优化反应的参数配置成Mix，实验时在成品Mix中直接加入目的片段和相关引物，大大简化PCR实验中试剂添加过程。

那么如此具有划时代影响力的分子生物领域技术是如何诞生的呢？在这里让我们把这段历史小小的扩展一下。让我们把时间线退回至1953年，那年发生了什么呢？新中国的第一个五年计划？奥黛丽·赫本因《罗马假日》获奥斯卡最佳女主角奖？呃呃，扯远了……(ノ｀Д´)ノ 当然是沃森和克里克提出DNA是通过互补配对的碱基形成反方向平行的双螺旋脱氧核苷酸长链啦！也就是这张在生物学界流传甚广的历史照片：

    上图左边那位坐着仰望的是沃森，右边站着意气风发指点模型的正是克里克^_^ 顺便插一句克里克已于2004年因病去世了，而沃森老还健在，不过克里克本来也比沃森大十二岁……

    他俩依此结构进一步推测这可能暗含着遗传物质的复制机制，不过这需要实验来证明。事实上，差不多就在DNA双螺旋结构模型提出前后，Kornberg领导的小组就在研究DNA复制的机制，1956年他证实了DNA是一种能够进行自我复制的分子，并在1957年鉴定了第一个DNA聚合酶，尽管此酶功能很有限但是它打开了通往DNA复制机制研究的大门。1959年，因Kornberg发现细菌DNA复制机制和在试管中重现DNA复制过程而荣膺诺贝尔生理医学奖，1962年，Watson和Crick因DNA双螺旋结构模型也获得了诺贝尔生理医学奖。

　　1969年，美国印第安那大学的微生物学家Thomas Brock和他的研究生Hudson Freeze从黄石国家森林公园火山温泉中发现了一种嗜热型海栖热袍菌T.aquaticus (Taq)，为后来1976年Trela和他的华裔研究生钱嘉韵Alice Chien分离纯化到耐受>75°C热稳定Taq DNA聚合酶奠定了坚实的基础(Deoxyribonucleic Acid Polymerase from the Extreme Thermophile Thermus aquaticus)。因发现遗传密码子(genetic code)及其在蛋白质合成中的功能而获得1968年诺贝尔奖的印裔学者Gobind Khorana，他指导的博士后Kleppe等人在1971年的分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)首先发表了后来被称为“指导PCR在技术具备可行性”的文章，他在这篇文章这样写道：

    “一个双链分子想要获得两个同样的结构，并且每个都含有包括引物在内的模板链全部碱基长度，需要加入DNA聚合酶完成这样一个修补复制过程，最后，一个原来的双链分子就产生了两个同样的双链分子。整个循环过程需要不断重复，而且每次都要添加新鲜活力的聚合酶。”

　　在这篇文章中这位挪威籍的小伙子Kleppe明确提出了修补复制 (repair replication) 的概念，这就是后来被学界称为PCR技术的雏形，但在当时，测序技术并没有发明，热稳定性DNA聚合酶（StarLighter 热启动Taq DNA 聚合酶，FS-P2001）也没有发现，加之合成引物还只是停留在一种科学性质的行为艺术，所以这个想法很快被学界忘记在一边。然而好的思想就像一束火花，而散落的火星总是无意间引燃一个火种。事实上，这篇文章的工作早在1969年在新罕布什尔州 (New Hampshire)举行的高登会议上(Gordon Conference)，Kleppe就向与会者描述了一个双链DNA分子产生两个同样结构的双链分子技术，而高登会议(Gordon Conference)则好比是美国学术界每年一次的“华山论剑”。值得一提的是，当时在场的听众中有一位叫Stuart Linn的教授，他在自己随后的教学中按照Kleppe描述使用这些反应组成物演示了这个试验，在场听课的学生中有一位叫Karry Mullis，是他接过PCR研究的接力棒并完成了最终冲刺。

　　1979年，Sanger在《美国科学院院刊》PNAS上发表了题为“链末端终止DNA测序法”的文章，在这篇文章中Sanger提到了寡核苷酸引物，DNA聚合酶（Star