qpcr定量的方法
荧光定量实验设计时,定量方法怎么选?相对定量还是绝对定量?相对标准曲线法还是ΔΔCT法?
荧光定量PCR(StarLighter SYBR Green qPCR 预混液(通用型))实验方法要根据试验目的进行设计。一般来说荧光定量PCR要达到的目的有两种:
1 检测样本中某个基因或物种的准确含量,这种方法称为绝对定量法。如一定体积血液中某病毒的含量,或一定水体中某种菌的含量。
2 检测不同样本中某个基因的相对表达情况,这种方法称为相对定量法。如经过不同处理,植物组织中某个基因的表达上调或下调情况。
预实验很重要
在我们展开阐述绝对定量和相对定量的具体实验设计之前,我们先了解荧光定量实验要达到准确定量样本的前提是什么?
准确度高——荧光信号-CT值与目的产物呈标准线性关系;
重复性好——3个及以上重复操作且误差范围小;
动力学范围宽——在较宽的浓度范围内能检测准确。
以上要求,我们都可以通过预实验来进行判断:根据我们上一篇引物设计的介绍,设计出特异性定量引物,使用特异性引物设计预实验:
引物及操作验证
对一个样本的核酸进行连续梯度稀释(推荐5个点的10倍稀释,如果cDNA浓度