二代测序中DNA定量常见方法

二代测序中DNA定量常见方法

二代测序（NGS）实验中，我们需要将精确量的DNA文库上机到测序仪中。如果测序运行时的文库分子过多则会导致检测簇过多而发生读取错误，过少则会降低测序芯片的利用率，两者都会使数据质量受损。这不仅浪费宝贵的样本和试剂，也浪费我们和仪器的时间。本文对目前常用的DNA浓度定量方法进行了阐述及相关试剂的介绍。

紫外吸收法

以往我们大多采用分光光度计来测定260 nm处的吸光度，对DNA和RNA进行定量。其原理是组成 DNA 的嘌呤碱和嘧啶碱都具有共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在 240～290 nm 范围内有特征吸收，其吸收强度与核酸浓度成正比。由于结构上的差异，各组分紫外吸收也有区别，其中 DNA 在 260 nm 附近有最大吸收 ，据此可用紫外吸收法对 DNA 进行定量、定性测定。

紫外吸收法具有简便、快速等特点，样品便于回收，但是由于DNA 的摩尔吸光系数仅 103数量级，灵敏度不高，不适于微量或痕量 DNA 片段的检出和 DNA 序列分析的要求。因此，此法要求 DNA 样品有相当高的纯度。核酸分子的单链、双链之间的转换，对光吸收水平有一定影响，其偏差需要用特定的公式进行校正。此外，紫外吸光度测量不具有选择性，无法区分DNA、RNA或蛋白质。而一些游离核苷酸或多余的盐离子也会影响检测的数值。另外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。

荧光光度法

有些小分子与 DNA 结合后，会使原本荧光很弱的核酸分子荧光强度增强很多;而有些小分子与 DNA结合后，会发生显著的荧光猝灭作用。利用这些现象，可用荧光光度法检测 DNA 及获得热力学和动力学数据。由于荧光光度法具有灵敏度高，选择性好、仪器设备简单、操作简便等优点。目前在生物分析中受到人们的广泛关注。

Picogreen染料是一种新型的 dsDNA荧光染料，采用PicoGreen直接与DNA双链结合，结合后荧光强度大大增加，其检测灵敏度高，可检测到pg 级 DNA，可以对100pg/ml的双链DNA定量测定，其线性范围广可跨越 4 个数量级。特异性好，基本不受 ssDNA 和 RNA 的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前该方法已经纳入2010版《中国药典》选为药物残留 DNA 定量方法。

该方法可测定来源于任何表达宿主样中的双链DNA，可以直接定量 PCR 扩增产物而无需从反应混合物中纯化 DNA，比较方便快捷，只需要一小时。远远超出传统紫外（ A260）检测法的灵敏度，明显优于其它高灵敏度检测方法 。