ddPCR--数字微滴PCR

ddPCR–数字微滴PCR

ddPCR应用方向： 拷贝数变异研究、复杂来源样品中含量极低核酸分子的检测、NGS数据验证、NGS测序文库的鉴定、miRNA等差异微小的基因表达研究。

1.ddPCR的背景介绍

**ddPCR（dropletdigital PCR）：**在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级别的微滴（其中，每个微滴含有的待检测靶分子为0个、1个或多个）。经过PCR扩增之后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

目前有两种主流的实现形式：

• 油包水的ddPCR（用油把PCR反应液分隔成等体积的小液滴，再进行PCR反应）
• 芯片微孔的ddPCR（在芯片上预制了2万个小孔，把PCR反应液，物理地注入到芯片上的小孔中，密封后，进行PCR反应）

因为先写过10X genomics的文章（https://www.jianshu.com/p/566f51997a37），理解其单细胞测序是通过“油包水”结构将细胞逐个分离实现的。因此再来看ddPCR的时候，同样涉及到“油包水”结构，很容易让人误解为：它是通过将“目标基因序列”逐个分配到“油包水”微滴中实现的（事实上，ddPCR的技术还做不到一一分配的效果😂）。
我更倾向于这么理解这项技术：将待测样品随机分配到20,000个互相隔离的单元内（每个单元内分配到“目标基因序列”的数目符合泊松分布–一种统计与概率学里常见到的离散机率分布）；每个单元内都独立进行qPCR反应，荧光信号强度与单元内“目标基因序列”的数目成正比（qPCR的链接https://www.jianshu.com/p/1beacb4df8e7）；通过检测接近20,000个单元内的荧光信号强度，结合泊松公式推导出样本中目标基因的浓度。

这么长的一堆文字介绍，理解起来还是着实费力吧？对于这种技术原理的理解，还是动画形式更方便，我就是个老好人，动画链接精心挑选如下：https://www.bilibili.com/video/BV1Bt4y1X79e?p=1&share_medium=iphone&share_plat=ios&share_source=COPY&share_tag=s_i&timestamp=1610781003&unique_k=8JyMfj

2. ddPCR用于低频突变检测

下面的描述，以Bio-Rad公司的仪器和方法为例介绍吧。

2.1 制备ddPCR反应液

首先每个样本，准备20ul的反应液

• 与常规Taqman法一样的2种探针（野生型和突变型2种探针）
• 待测样本DNA（建议使用打断的原始基因组DNA）
• 酶
• dNTP和缓冲液

2.2 制备油包水的乳浊液

反应液加在专用的塑料载片（cartrige）上。
在这个载片上，有3排孔，每排是8个孔

专用的塑料载片

3排孔：

• 中间一排放反应液
• 上面一排是放油的
• 另一排用来回收乳浊液

第一和第二排孔，都通过底下的预制的微孔管路，连接到第三排孔（因此一次可以放8个反应液），然后将载片放入仪器中，仪器把油和水同时挤进下面的特制的微孔管路中，挤出来就形成油包水的乳浊液进入第三排孔中。

制备油包水的乳浊液

2.3 PCR扩增

制备好的乳浊液放到普通的PCR仪中，做40个PCR循环。

在PCR进行的过程当中，如果一个微滴当中有一个、或更多个目标基因片段，Taqman探针就会被酶切碎，导致荧光基团和猝灭基团分离，在后面被激发光照射之后，就会发出荧光。如果一个微滴当中没有目标的基因片段，Taqman探针就不会被切碎，在后面的检测过程当中，荧光基团吸收到激发光的能量还是会被猝灭基团所猝灭，那么这个微滴的荧光水平，只会保持在本底水平。

2.4 读数仪读取微滴荧光

40个PCR循环完成之后，就用读数仪（reader）进行读数。在读数的过程当中，微滴依次地通过扫描仪中的毛细管（和用流氏细胞仪来读细胞的荧光，是差不多的道理）。读数仪会把读到的信号记录下来，进行分析。

一个微滴会有2种颜色的荧光信号被记录下来（红色-突变型；绿色-野生型），对于读到的信号，仪器经过计算，给出每微升的反应液当中，有多少个突变型基因序列和野生型基因序列，由此推算突变频率。

不过需要解释的是：并不是说一个样本中检测到了几个亮点，这个反应当中就有几个目标基因的拷贝，因为目标基因的片段，在微滴当中的分布，是符合泊松分布的，也就是说一个发光的微滴中，可能有一个目标基因的拷贝（也可能有2个、3个、4个甚至更多），所以，发光的微滴数与原始的基因拷贝数，并不是一对一的线性关系