HISAT2+STRINGTIE+BALLGOWN 分析转录组数据

师兄推荐这篇文章，按照里面的命令，先做一套转录组分析。

参考文献：

Pertea M, Kim D,Pertea G M, et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experimentswith HISAT, StringTie and Ballgown.[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650.

全文链接：http://www.ccb.jhu.edu/people/infphilo/data/nprot.2016.095.pdf

我是借鉴的简书上的一篇博文，https://www.jianshu.com/p/38c2406367d5，谢谢这个博主啦！

数据 ：https://pan.baidu.com/s/1aX93Q65Dit3iqslRWkQcsw

  genes  针对基因组的注释文件.gtf

  genome  染色体X的序列文件 chrX.fa

  geuvadis_phenodata.csv 

  mergelist.txt  以上两个都是之前博主创建表明数据关系的文件

  indexes  hisat2对于染色体X的indexes文件，1~8.ht2 索引文件

  samples  数据  fastq.gz

文章背景： 见文章 

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转录组分析 背景知识： 

       从原始RNA-Seq数据着手，质控——建立索引文件——比对、拼接、排序——初组装——合并——计算表达量，并输出为baoogown格式——进行差异分析——作图，这里输出结果包括基因list、转录本，及每个样本的表达量，能表现差异表达基因的表格 并完成显著性计算。

       在R里使用ballgown处理需要得到：   #了解一下就OK

       1. 表型数据    关于样本的信息

       2. 表达数据    标准化和未标准化的关于外显子，junction，转录本，基因的表达数量

       3. 基因信息    有关外显子，junction，转录本，基因的坐标以及注释信息

       大多数差异表达分析都会包括一下几个步骤：       #需要着重理解

       1. 数据可视化和检查

       2. 差异表达的统计分析

       3. 多重检验校正

       4. 下游检查和数据summary

        ballgown的使用：    #分析过程的难点在ballgown，提前理解有助于后面，现在回过头来看还是很懵逼……

        1. 数据的读入

      2. 预测丰度的检查：以FPKM为单位的丰度预测将会根据library size进行标准化。FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）

        3. 使用线性模型进行差异表达分析，由于FPKM对于转录本解读过于曲解，所以这里需要使用log转化处理数据，随后再使用线性模型进行差异分析。 

        4. ballgown可以对于time-course和fixed_conduction数据进行差异分析，但是无法避免批次效应带来的误差。# 使用stattest功能可以指定任何已知的confounder

        5. ballgown 可以帮助你在基因、转录本、外显子、junction水平上进行差异分析。

        6. 结果会以表格形式展出，如果样本多还有p值和q值。

        7.