一、背景
在社会科学与管理学领域，应急管理遵循一项核心原则，即构建专门的应急指挥中心，该中心负责整合信息、规划应对策略、分配职责以及调配资源。相类似地，在生物学领域，免疫系统亦采纳了类似的策略以对抗微生物的侵袭，即形成结构化的淋巴组织。在感染初期，传统的树突状细胞（conventional dendritic cells, cDCs）负责将侵入生物的信息传递至附近的淋巴结，后者与脾脏、扁桃体和派氏斑等器官共同构成了**次级淋巴器官系统。在淋巴结内部，大量的效应T细胞在调节性T细胞的监管下，通过识别cDCs表面的同源抗原，以优化免疫反应**。
然而，对于广泛及慢性的威胁，则需要更接近战场的临时指挥中心。在此背景下，“三级淋巴结构”（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）与“淋巴滤泡”等**新生前沿淋巴样组织应运而生，其形成过程被称为淋巴新生（lymphoid neogenesis）。淋巴新生现象可在多种感染器官内观察到，同时也见于自身免疫和炎症性疾病过程，以及器官移植和恶性肿瘤**中。
三级淋巴结构（TLS）是指在某些非淋巴组织中发现的类似淋巴的结构。TLS常见于多种**发炎的组织中，能够驱动免疫细胞的活化，并且其形成与慢性炎性疾病、自身免疫病和癌症等多种慢性疾病相关联。特别是在肿瘤微环境中，TLS能够促进免疫细胞浸润至实体瘤，因此TLS的形成与未经治疗的患者的生存率有显著相关性。相应地，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中，TLS的形成通常与改善的治疗反应相关联，提示TLS可能是产生抗肿瘤免疫反应的关键位点**。因此，TLS作为提高患者抗肿瘤免疫力和优化治疗反应的一种手段，引起了广泛关注。
最近，Schumacher和Thommen教授合作回顾了TLS生物学概念的发展，并概述了TLS研究的最新进展，探讨了**如何检测和定义TLS，其在癌症中的形成机制，以及如何利用TLS作为预测免疫治疗效果的潜在生物标志物**。
【IF:56.9】Schumacher TN, Thommen DS. Tertiary lymphoid structures in cancer. Science. 2022 Jan 7;375(6576):eabf9419. doi: 10.1126/science.abf9419. Epub 2022 Jan 7. PMID: 34990248.
二、全文速览
三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）是指**在个体出生后于非淋巴组织中形成的组织性免疫细胞聚集。在正常的生理状态下，TLS 并不存在于体内。这类结构通常在慢性炎症的背景下形成，如自身免疫性疾病、慢性感染以及癌症等病理状况。尽管存在少数例外，肿瘤中 TLS 的存在通常与免疫治疗后的良好预后和临床结果相关联**。
尽管 TLS 被认为在肿瘤免疫中扮演着重要角色，但其形成的驱动因素以及这些结构对肿瘤内免疫反应的具体影响尚未完全阐明。因此，整合现有关于 TLS 在癌症中的知识对于深化对该新兴领域的理解至关重要。
本研究的重点包括
1）TLS 形成的驱动因素；
2）TLS 在**抗肿瘤免疫反应**中的功能及其贡献；
3）TLS 作为人类**癌症治疗干预靶点**的潜在价值。
▲ 多重免疫荧光染色：免疫细胞在两个 TLS 中的分布：B细胞 (绿色: CD20)，T 细胞(黄色: CD3)，巨噬细胞 (品红: CD68)， 辅助性 T 细胞 (橙色为: CD4)， 杀伤性 T 细胞 (红色: CD8) 和 DNA (蓝色: DAPI)。
三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）在解剖学上类似于次级淋巴器官（Secondary Lymphoid Organs, SLO），其最初被认为是由于类似的刺激因素而形成。然而，目前的文献资料表明，诱导这两种不同淋巴结构形成的细胞类型和信号机制并不完全一致。
例如，有研究证据指出，肿瘤特异性 T 细胞和B 细胞的免疫反应可能提供了TLS形成和持续所需的某些分子信号，而这些驱动因素的异质性也可能导致了不同TLS之间的状态差异。据推测，TLS在炎症组织部位可能执行与SLO相似的功能，现有研究结果表明**TLS对肿瘤特异性免疫反应的强度具有潜在贡献**。然而，目前对于TLS的这种贡献是否主要涉及增强SLO中产生的T细胞反应性，或是促进新的T/B细胞反应性的发展，尚不明确。
▲ 二级和三级淋巴结构的基本特征 （Nature Review Immunology）
此外，肿瘤部位的三级淋巴结构（TLS）的存在可能为产生不同特性的免疫反应提供了潜在的平台。具体来说，由于**TLS并非封闭系统，TLS中驻留的免疫细胞可能直接接触来自炎症微环境中的信号分子**，这一特性可能会影响肿瘤内免疫反应的独特性。最近的研究发现，TLS在免疫检查点阻断的临床反应中扮演着关键角色，这可能使得这些结构成为具有吸引力的治疗靶点。然而，制定此类治疗策略时应考虑身体其他部位淋巴组织异位形成的潜在后果。
TLS在癌症中的预后和预测价值激发了人们对其抗肿瘤免疫潜力的探索兴趣。尽管TLS已在多种癌症类型中被鉴定，但**用于定义和表征TLS的标志物在不同研究中并不一致**，这增加了比较预测值和评估癌症类型间TLS异质性的复杂性。因此，开发标准化方法以测量TLS的数量和组成，可能有助于进一步揭示TLS在不同疾病环境中的预测和预后价值。
与此相关的是，通过对TLS的细胞组成、位置、成熟度和功能等方面的全面评估，可能会促进对TLS不同状态的识别。这与癌症中T细胞状态的定义相似，将显著提升我们对特定T细胞亚群在肿瘤特异性免疫过程中的作用的理解，而TLS状态的分子水平定义，将增强TLS作为预后和预测标志物的潜在价值。最后，更好地理解TLS的功能及其对自身免疫毒性的潜在贡献，对于最大化TLS作为新的潜在治疗靶点的价值具有重要意义。
三、TLS基本概念
多年来的研究表明，肿瘤病变部位特定免疫细胞的浸润与多种癌症类型的良好预后相关。近期，通过输注体外扩增的肿瘤浸润T淋巴细胞（TIL）或通过阻断T细胞的免疫检查点分子以增强肿瘤特异性T细胞反应，已显示出显著的治疗效果。此外，活跃的免疫浸润与肿瘤对免疫检查点阻断（ICB）治疗反应的良好相关性自然地将免疫治疗与三级淋巴结构（TLS）联系起来。尽管这些数据支持对癌症病变中的免疫浸润进行常规评估，但越来越多的证据表明，我们不仅可以分析癌症部位免疫细胞的存在，还可以收集关于免疫细胞定位和相互作用的额外信息。
一种相对简单的优化方案是**根据T细胞在肿瘤边界或肿瘤实质中的位置对T细胞进行细分**。正如预期，肿瘤实质中T细胞的浸润与较好的临床结果相关，但这一现象是否反映了具有持续肿瘤特异性T细胞反应的肿瘤对T细胞的吸引力增强，或者是T细胞在排斥其他肿瘤中的主动浸润，仍然是一个需要解决的重要问题。
除了肿瘤内免疫细胞的位置，肿瘤内免疫浸润细胞的聚集模式也非常关键。例如，对乳腺癌中免疫浸润的分析表明，即使免疫细胞浸润的比例相似，肿瘤可能会表现出截然不同的空间分布模式，即混合和区室化组织。更重要的是，由免疫细胞簇和癌细胞簇物理分离定义的分隔组织与患者生存率的提高显著相关，而与TIL密度无关。尽管在这项研究中，预后预测潜力并未正式与TLS的存在相关联，但最近在多种人类恶性肿瘤中的其他研究已经报告了TLS与改善预后和对ICB的反应相关。
总体而言，这些观察结果表明，尽管肿瘤中的免疫浸润至关重要，但以TLS为组织形式的肿瘤浸润免疫细胞可能具有更重要的意义。在未来几年中，我们应该进一步探讨的主要问题包括癌症中TLS形成的分子过程、癌症相关TLS的类型以及它们的存在对产生或维持肿瘤特异性免疫的客观结果的影响。
四、癌症中免疫浸润的组成和组织
三级淋巴结构（TLS），亦称为三级淋巴器官或异位淋巴结构，是指在个体出生后在非淋巴组织中形成的由免疫细胞构成的有组织的聚集体。TLS在生理状态下并不出现，而是在慢性炎症的背景下形成，这些慢性炎症条件包括自身免疫性疾病、同种异体移植物排斥、慢性炎症和癌症等。
TLS已在多种癌症类型中得到报道，例如非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）、卵巢癌和黑色素瘤。TLS的发生可能因癌症类型的不同而有所差异，但由于目前可用的数据集使用了多种不同的标记物来识别TLS，因此不同癌症类型之间的数据尚无法直接进行比较。
▲ 三级淋巴结构的组分及分布示意图（Cellular & Molecular Immunology）
在以下段落中，我们将概述**三级淋巴结构（TLS）的结构特征**：CD20+ B细胞的核心区域被CD3+ T细胞所包围，形成类似次级淋巴器官（SLO）的淋巴滤泡结构。尽管不同TLS的具体组成可能存在变异，但CD4+ T滤泡辅助（TFH）细胞通常是T细胞区室中的主要细胞亚群，同时CD8+细胞毒性T细胞、CD4+ T辅助1（Th1）细胞和调节性T细胞（Tregs）也可能出现。
虽然**B细胞和T细胞群构成了TLS相关免疫细胞的大部分**，但TLS还包含不同的树突状细胞（DC）亚群。例如，CD21+滤泡树突状细胞（FDC），它们起源于间充质，主要定位于T细胞区，并在TLS中发挥关键作用。滤泡还包含分散的CD68+巨噬细胞，其功能类似于在SLO中清除凋亡细胞的作用。
TLS还包含致密的基质网络，类似于SLO中由滤泡网状细胞（FRC）形成的网络，将TLS锚定在慢性炎症的组织部位。最后，TLS具有外周淋巴结寻址素（PNAd）阳性的高内皮小静脉（HEV），它们为TLS提供了特殊的脉管系统，被认为介导了淋巴细胞的募集。
▲ TLS 的结构与功能
近期的研究描绘了癌症中存在的另一类结构化的免疫浸润模式。具体来说，在肾细胞癌中，肿瘤内的免疫细胞或**抗原呈递细胞（APC）**生态位被定义为每 10,000 μm² 含有超过 5 个 MHC II+ 细胞的 APC 密集区域。这些区域富含肿瘤反应性干细胞样 CD8+ T 细胞，这对于小鼠模型中产生持久的免疫治疗反应至关重要。
值得注意的是，APC 构造的缺失与肿瘤进展相关联，暗示这些结构可能在控制肿瘤进展中发挥着关键作用。尽管 APC 生态位与 TLS 在结构上有所不同，后者是由多种类型的细胞聚集而成的、富含 B 和 T 淋巴细胞的较大组织结构，但**目前尚不清楚 APC 构造是否代表了 TLS 形成的早期阶段**。
▲ 瘤内 APC 构造维持干细胞样 CD8 + T 细胞 （ACIR）
五、TLS 形成的驱动因素
次级淋巴器官（SLOs）分布于全身，包括淋巴结、脾脏、扁桃体、派氏斑和黏膜相关淋巴组织。SLOs 允许免疫系统从不同组织中采集抗原，并将各种免疫细胞聚集于此，从而促进适应性免疫反应的诱导。在持续的慢性炎症情况下，淋巴组织会发生结外播种，并在炎症部位形成三级淋巴结构（TLS）。为了更好地理解此类 TLS 的发展，可以将其与胚胎发生过程中 SLOs 的形成进行对比。
SLOs 的播种和组织，特别是淋巴结和派氏斑，是由一系列高度有序的事件引起的。这些事件涉及造血细胞和非淋巴基质细胞之间的相互作用，以及细胞因子、趋化因子、粘附分子和生存因子等分子组分的至关重要作用。
SLO 形成始于胚胎发育早期的造血淋巴组织诱导（LTi）细胞、CD4+ CD3- CD45+ 先天淋巴细胞定植于淋巴结原基。这些细胞从胎儿肝前体分化而来，特征在于 RORγt 和 Id2 转录因子的表达。LTi 细胞的聚集以依赖肿瘤坏死因子（TNF）家族成员的方式驱动 SLO 形成的初始步骤，其中淋巴毒素 α1β2（LTα1β2）和 TNF 在某种程度上起到了核心作用。因为无论是缺失 LTi 细胞还是 LTα1β2，都将阻碍淋巴结和派尔斑的形成。
LTα1β2 和 TNF 与间充质淋巴组织组织者（LTo）细胞上各自的受体 LTβR 和 TNFR1 结合，从而促进血管细胞粘附分子1（VCAM1）、细胞间粘附分子1（ICAM1）等粘附分子的表达，进而诱导黏膜寻址素细胞粘附分子 1（MAdCAM1）和 PNAd，以及一组称为淋巴或稳态趋化因子的趋化因子的产生（包括CCL19、CCL21和CXCL13）。随后，这些分子共同调节免疫细胞募集到淋巴生态位，以及调控高内皮小静脉（HEV）的血管形成。最后，新生淋巴滤泡的区室化是通过稳态趋化因子的分隔表达来实现的，例如，CCL19+ 和/或 CCL21+ 滤泡网状细胞（FRCs）和 CXCL13+ 滤泡树突状细胞（FDCs）指导表达相应 CCR7 和 CXCR5 受体的淋巴细胞的分布，从而允许形成 T 细胞区和 B 细胞区。值得注意的是，淋巴趋化因子分泌诱导的正反馈回路对于维持淋巴生态位也是至关重要的，因为已发现通过在 B 细胞和 LTi 细胞上表达的 CXCR5 发出信号可诱导 LTα1β2 表达。
三级淋巴结构（TLSs）展现出与次级淋巴器官（SLOs）明显的解剖学相似性，尽管大多数组织中的TLS都缺乏周围包膜。这种无封装的特性可能允许其细胞成分直接进入周围组织，但同时也可能使TLS中驻留的免疫细胞暴露于发炎微环境中的大分子。尽管TLS和SLO的形成最初被认为是由相同的分子因子诱导，包括LTα1β2-LTβR信号传导以及粘附分子和淋巴趋化因子的局部表达，但所涉及的细胞成分并不完全相同，且推动TLS生成的刺激事件尚不完全清楚。
此外，许多独立于淋巴毒素信号传导的TLS分子诱导剂已经见诸报道。重要的是，我们对驱动TLS形成的细胞和分子过程的大部分理解是在自身免疫性疾病和慢性感染模型中获得的，因此在这些疾病模型中的发现只能被视为关于TLS形成的一种参考。
关于TLS的上游启动机制，目前尚不清楚是否需要真正的LTi细胞来启动局部间充质积累，或者局部聚集的免疫细胞是否可以替代LTi细胞。支持后一种假设的几种免疫细胞亚群——包括Th17细胞和先天性淋巴样细胞3（ILC3），这些已在小鼠和人类同种异体移植排斥、自身免疫、慢性炎症或癌症中被观察到。值得注意的是，与SLO形成不同，TLS的诱导可能并不总是依赖于淋巴毒素。例如，由T细胞产生的白细胞介素17（IL-17）可以诱导小鼠基质细胞中CXCL13和CCL19的表达，从而促进支气管相关淋巴组织（iBALT）的形成，这是一种在肺组织中形成的TLS。同样，LTa-/-小鼠中确实会形成淋巴样聚集物，尽管这些结构没有显示出T和B细胞区的分离并且缺乏高内皮小静脉（HEV），因此可能不被认为是典型的TLS。
为了支持局部组织环境在确定TLS组成中的作用，已显示**小鼠模型中不同细胞因子和趋化因子的转基因表达可诱导具有不同特征的TLS**。例如，CXCL13的组织特异性表达诱导缺乏FDC网络的B细胞聚集体，而TNF和CXCL12表达诱导小淋巴细胞浸润，主要由B细胞和少量T细胞组成，在后一种情况下，还包括DCs。此外，尽管CCR7配体CCL19和CCL21显示出诱导相似组成的聚集体，但由CCL21表达诱导的结构更大且更有组织。
在不同的人类癌症类型中，也检测到了 TLS 成分的巨大差异。例如，在 NSCLC 的 TLS 中描述了 DC-LAMP+ DC，但在其他癌症类型中描述较少。此外，TFH 细胞大多被记录在乳腺癌的 TLSs 中。然而，我们需要明确的是，现在大部分可用的数据大多来自使用缺乏一致性的 TLS 标记。因此，目前还缺乏允许对癌症之间的 TLS 异质性进行严格评估和大规模分析的参数。已有一些证据表明，特定类型的异质性特征与 TLS 成熟程度有关。基于与 SLO 的结构相似性，淋巴结构的三个成熟阶段已在 NSCLC、肝细胞癌 (HCC) 和 CRC 中被定义。组织程度最小的阶段由密集的淋巴细胞聚集组成，不存在 FDC，并且缺乏真正 TLS 特征（分离的 T 和 B 细胞区）。初级卵泡样 TLS 确实含有 FDC，但缺乏 GC 反应。相反，完全成熟的次级卵泡样 TLS 也显示出活跃的 GC，可能反映了它们的全部功能。
尽管大量工作确定了许多影响肿瘤微环境中 TLS 形成的因素，但我们**对有利于或不利于 TLS 形成的局部环境的特定分子决定因素的理解或许还远未完成**。作为对不发生 TLS 形成的不同肿瘤微环境进行分类的框架，我们建议将 TLS 形成被积极抑制的“限制性组织环境”与“不充分的组织环境”区分开来，其中可能缺乏必要的驱动因素，例如抗原。
六、TLS 在调节肿瘤特异性免疫反应中的作用
鉴于三级淋巴结构（TLS）在解剖学上与次级淋巴器官（SLO）相似，一些研究者认为TLS是在发炎组织部位重现SLO的功能。SLOs，尤其是淋巴结，通过提供一个最大化的细胞-细胞相互接触的特殊生态位，增加来自组织的载有抗原的抗原呈递细胞（APCs）和来自血液的幼稚淋巴细胞的接触几率，从而提高产生适应性免疫反应的效率。
越来越多的证据表明，适应性免疫反应也可以在TLS中产生或得到增强。TLS中与B细胞相关的主要效应功能之一是产生疾病相关的抗体，这些抗体具有标记抗原表达细胞的调理作用、补体介导的裂解作用或抗体依赖性细胞毒性。已发现TLS中的生发中心（GC）的形成与血清自身抗体浓度、疾病严重程度和几种自身免疫性疾病的器官功能下降相关，包括干燥综合征、重症肌无力和桥本甲状腺炎，这表明**TLSs对疾病进展可能具有潜在的影响**。
一个还未解决的重要问题是，TLS是否主要用于重新激活或再教育效应T细胞，或者它们是否主要支持幼稚T细胞的启动。已有研究报道了与TLS相关的Th17细胞可以在自身免疫性脑脊髓炎模型中获得滤泡辅助T细胞（TFH细胞）的表型特征，这表明效应群体的再教育可能发生在TLS中。另一方面，也有研究描述了在非肥胖糖尿病小鼠的胰岛中将幼稚T细胞募集到TLS中，而这种幼稚T细胞确实会发生原位增殖，这提示了局部免疫反应的启动。同样，在发炎的中枢神经系统中，已发现TLS参与了自身反应性T细胞对内源性髓鞘肽的反应的局部启动。此外，在小鼠中已经观察到T细胞和B细胞对病毒抗原的反应在性质上与在淋巴结中引发的反应相似，但引起的免疫病理学改变较少。在改良的痘苗病毒安卡拉模型中，已观察到在阻断淋巴细胞从SLO流出后引发抗原特异性T细胞反应。此外，在鼠黑色素瘤模型中，由TLS驱动的肿瘤特异性T细胞反应已在没有SLO的情况下被确定，并导致免疫细胞浸润和肿瘤消退。总的来说，这些数据提供了令人信服的证据，证明TLS可以在局部重现SLO功能。
鉴于**经典的次级淋巴器官（SLO）是有效产生抗原特异性适应性免疫反应的关键位点**，人们期望了解在发炎的组织部位复制淋巴样结构的功能。鉴于目前关于TLS功能的信息有限，提出了一些模型来解释在感染或癌症部位创建淋巴生态位为何可能有利于解决这一开放问题（图1）：
- 1）速度：局部启动T和B细胞池可能会导致更快的免疫反应，因为它跳过了DC和淋巴细胞进出SLO的运输过程。与此一致，已有研究描述了幼稚T细胞进入肿瘤，并依赖于小鼠模型中表达PNAd和CCL21的脉管系统的发展。然而，考虑到TLS在慢性炎症的情况下才特别明显，“速度”论似乎不太令人信服。
- 2）效率：局部淋巴生态位的产生可能会增加疾病相关抗原与稀有的同源淋巴细胞之间相遇的可能性，从而可能诱导更强烈或更广泛的免疫反应。在该模型中，在TLS和SLO中诱导的T细胞和B细胞的功能和表型特性可能相同，但它们靶向的抗原可以不同。
- 3）控制：拥有与发炎组织部位直接接触的淋巴生态位可能会提供引导免疫反应的额外契机。例如，肿瘤组织中产生的细胞因子和/或代谢因子可能会渗透到TLS中，从而影响所产生的免疫反应的性质。
- 4）存活：在一些TLS中存在大量功能失调的PD-1高表达的CD8+ T细胞，这是一种与肿瘤免疫反应有关的表型。在这一模型中，TLS不仅用于诱导抗肿瘤免疫，还用于维持免疫反应。TLS相关成纤维细胞和其他细胞亚群分泌的存活因子支持TLS中的淋巴细胞稳态。类似地，这可能有助于肿瘤反应性T细胞在肿瘤部位的长期持续存在。
为了更好地理解产生异位淋巴微生境的好处和可能的坏处，我们还需要确定在TLS和SLO中诱导的免疫反应的异同，包括它们靶向的抗原、它们各自的特性，以及抗原特异性淋巴细胞池。根据需要诱导TLS形成或分解的实验方法的建立，可能有助于剖析它们对肿瘤驻留免疫细胞池的影响。
图 1. TLS 对抗肿瘤免疫的潜在贡献
**图 1. TLS 对抗肿瘤免疫的潜在贡献。**癌症组织中 TLS 的存在可以以不同的方式支持抗肿瘤免疫反应：
- (1) 速度：炎症反应部位 T 细胞和 B 细胞的启动可能会缩短产生免疫反应的时间，因为它绕过了 DC 和淋巴细胞从 SLO 到效应部位之间的运输。
- (2）效率：局部淋巴生态位的形成可能会促进更强或更广泛的免疫反应的诱导，因为淋巴细胞遇到同源抗原的几率更高。
- (3) 控制：将 TLS 相关免疫细胞直接暴露于发炎的组织环境中，可以微调针对特定输出信号的免疫反应。
- (4) 存活：促进淋巴细胞稳态和存活，既可以通过 TLS 相关细胞群分泌的存活因子，也可能通过效应 T 细胞与 APC 大反复接触。
七、TLS 的预后预测潜力
三级淋巴结构（TLS）与多种癌症类型的良好预后相关，且TLS的预后价值通常与TNM分期无关。例如，在肺癌、结直肠癌和胰腺癌中的记录表明，TLS的密度及其成分的存在（TFH细胞、滤泡B细胞、DC-LAMP+成熟DC和HEV等）与许多不同肿瘤类型的更好的存活率相关。
此外，与TLS相关的多个特征基因集已显示出积极的预后预测价值，包括卵巢癌中的浆细胞特征；头颈部鳞状细胞癌中的TFH特征；CRC、黑色素瘤和乳腺癌中与淋巴趋化因子相关的各种基因特征（包括CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL13）。此外，**肿瘤中TLS的存在通常伴随着免疫浸润的普遍增加。**例如，在人类NSCLC和三阴性乳腺癌中，与单独的CD8+ T细胞浸润相比，TLS和活跃的肿瘤内CD8+ T细胞浸润的组合可以更好地预测更好的预后，并且这一观察已被用作预测肿瘤中产生的优质免疫反应的证据。
我们容易将观察到的相关性解释为TLS在诱导或维持肿瘤特异性免疫中的核心作用的证据，但同样重要的是认识到**TLS的形成似乎依赖于抗原识别。因此，观察到的预后价值可能部分通过TLS的形成表明存在正在进行的免疫反应这一事实加以解释。为了进一步了解这个问题，比较存在于含有或缺乏TLS的肿瘤中的反应性T细胞的状态可能也非常有意义。此外，我们还需要确定影响小鼠模型中TLS形成的（肿瘤）细胞参数是否与抗原负荷无关，以随后测试它们对肿瘤控制的影响**。
尽管TLS通常与大多数癌症类型的良好预后相关，但**TLS的存在与某些癌症类型的肿瘤发展或进展有关。已有多种潜在的免疫抑制机制可以解释这一观察结果。首先，主要存在于TLS中的Treg的消耗改善了小鼠肺腺癌模型中的肿瘤控制，这表明TLS相关的Treg可能抑制内源性抗肿瘤T细胞反应。其次，除了作为肿瘤特异性抗体产生者，TLS驻留的B细胞还可能通过分泌IL-10等机制抑制肿瘤特异性免疫**。
此外，根据产生的抗体同种型和存在的免疫细胞类型，肿瘤特异性抗体还可以通过抑制性Fc受体发出的信号来抑制肿瘤特异性免疫反应。最后，基于HCC祖细胞在离开和形成肝肿瘤之前先出现在TLS中的现象，TLS已被建议作为可能促进恶性细胞转化和生长的微生态标志。同样地，人类乳腺癌的TLS中也检测到了癌细胞簇，它们的存在与淋巴浸润和更高的淋巴结分期有关。尽管上述观察结果为TLS组成和功能的异质性提供了证据，但促进肿瘤进展的“抑制性”TLS的直接证据仍然有限。开发原位特异性改变TLS属性的研究方法，可以提供解决此类因果关系问题的有效的实验手段。
近期研究亦支持**三级淋巴结构（TLS）在免疫检查点阻断（ICB）反应中的预测价值。具体而言，在黑色素瘤、肾细胞癌、软组织肉瘤和尿路上皮癌的预处理活检中，发现TLS和活跃的B细胞浸润与对PD-1或联合PD-1加细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）阻断有加成作用。同样地，大量TLS成分的存在，包括记忆样B细胞和浆母细胞样细胞，在黑色素瘤中ICB反应者的预处理活检组织中富集。此外，主要定位于TLS内的PD-1高表达的功能失调CD8+ T细胞的存在，被证明可以预测晚期非小细胞肺癌（NSCLC）对PD-1阻断的反应。有趣的是，TLS丰度与免疫细胞上的PD-L1表达相关，但与肿瘤细胞上的PD-L1表达无关**。
另一方面，对**治疗中肿瘤活检的分析表明，ICB治疗也可以促进TLS的形成。在高危型黑色素瘤和尿路上皮癌中使用新辅助ICB后，响应患者的肿瘤观察到更高数量的TLS相关的B细胞。在几项探索性的NSCLC新辅助PD-1阻断研究和尿路上皮癌中PD-1加CTLA-4阻断的研究中，已观察到消退肿瘤病变中TLS的增加。同样，ICB治疗增加了小鼠黑色素瘤模型中TLS的数量和大小，这与更好的肿瘤控制相关。考虑到TLS在促进抗原特异性T和B细胞反应中的作用，可以推测ICB不仅增强了TLS的形成，还增强了TLS的功能**。尽管许多观察结果与ICB影响TLS功能的模型一致，但这些都属于间接证据。在开始治疗后的早期时间点（数小时至数天）对肿瘤进行空间分析，或分析ICB处理的离体人类肿瘤培养物，应该有助于进一步直接解析这个问题。
八、TLS 的治疗性诱导
鉴于许多报道中三级淋巴结构（TLS）与疾病结果之间的关联，TLS的诱导可能形成一种富有吸引力的治疗策略。通过TLS相关细胞因子和趋化因子的组织特异性表达诱导局部TLS的可行性已在小鼠模型中得到证实，包括淋巴毒素、TNFα、LIGHT、CXCL13、CCL21、CCL19和CXCL12。
此外，在乳腺癌和神经内分泌胰腺癌的小鼠模型中获得了TLS可以在治疗过程中被诱导并与肿瘤控制相关的证据，其中PD-L1阻断与抗血管生成疗法的结合导致肿瘤血管转化为高内皮小静脉（HEV），随后TLS形成并增加的CD8+ T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
另外，已有研究者在人类癌症中观察到独立于免疫检查点阻断（ICB）的TLS诱导途径（图2）。
**图2. 癌症治疗对 TLS 的潜在影响。**已发现几种治疗策略可诱导或促进癌症中 TLS 的形成。例如，新辅助化疗被证明可促进 NSCLC和肝母细胞瘤中 TLS 的从头发展。类似地，癌症疫苗被证明可以促进胰腺癌或 CIN2/3 病变中 TLS 的形成。尽管 ICB 已被证明可以增加多种癌症类型中 TLS 数量，但目前尚不清楚其是否也能诱导新生 TLS 形成。此外，ICB 也可能通过促进效应和记忆 T 细胞的生成、TFH 细胞和 B 细胞类别转换的诱导来增强小鼠和人类的 TLS 功能。基于这些现象，或许 ICB 也可以诱导 TLS 成熟，不过目前还缺乏直接证据。
例如，在患有高级别宫颈上皮内瘤变（CIN2/3）的患者中接种针对人乳头瘤病毒癌蛋白的疫苗后，可以在消退后的病变组织中观察到TLS的形成和TLS的克隆扩增。同样，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子分泌胰腺肿瘤疫苗（GVAX）联合环磷酰胺进行治疗性疫苗接种，导致绝大多数胰腺癌患者形成了TLS。这些不同类型的疫苗接种中观察到的TLS诱导提供了强有力的证据表明，抗原特异性免疫反应的强度是人类疾病中TLS形成的决定性因素。常规疗法对TLS的形成也有影响，例如在非小细胞肺癌（NSCLC）和APC基因突变相关的肝母细胞瘤的新辅助化疗中已经观察到TLS的诱导。值得注意的是，鳞状细胞肺癌出现了相反的现象，有报道表明新辅助化疗导致TLS成熟障碍和生发中心（GC）丢失。此外，在肺癌和尿路上皮癌的类固醇治疗（通常与化疗同时使用）后也出现了类似的结果。目前尚不完全清楚对TLS组织的负面影响是否取决于所使用的化疗类型或伴随的类固醇治疗。
值得考虑的一个重要因素是，尽管诱导或增强TLS功能可能会改善肿瘤控制，但此类干预也可能同时增强其他组织部位的自身反应性T和B细胞反应。自身免疫反应被观察为ICB治疗的主要毒副反应类型，这些所谓的免疫相关不良事件类似于自身免疫性疾病中的常见炎症过程，包括关节炎、肌炎、甲状腺炎、血管炎和结肠炎。
考虑到已发现TLS在许多自身免疫性疾病中支持局部炎症过程，因此**提高TLS数量或TLS功能的方法也可能增加ICB诱导的自身免疫毒性。尽管目前关于TLS在免疫相关不良事件中的作用的数据很少，但已有报道称TLS形成与PD-1阻断后的自身免疫性肌病之间存在关联。具体而言，抗PD-1治疗后对出现了肌痛和肌肉无力的患者进行活检，结果显示CD8+ T细胞驱动的肌肉组织破坏与表达PNAd和CCL21的TLS样结构的形成有关。因此，诱导或增强TLS功能虽然可能有助于促进抗肿瘤反应，但也可能促进自身反应性T和B细胞的扩增，因此未来的临床应用需要仔细评估这些方法的风险效益比**。
九、全文总结
近期研究揭示了三级淋巴结构（TLS）在癌症中的预后和预测价值，激发了人们对这些结构作为抗肿瘤免疫潜在手段的兴趣。
现有证据表明，TLS有助于增强肿瘤特异性免疫反应是合理的。然而，我们仍不清楚该现象是因为次级淋巴器官（SLO）中产生的T细胞反应的增强，还是由于新T细胞和B细胞抗肿瘤反应性的优化。类似地，肿瘤部位TLS的存在为通过局部因子导致不同性质的免疫反应提供了明确的可能性。然而，目前还缺乏在TLS中形成或增强的免疫反应的独特性质的直接证据。TLS已在多种癌症类型中的研究结果表明其预后预测价值毋庸置疑，但我们还**缺乏一致的标志物来定义和表征TLS**，而这将成为该领域未来需要关注的一个方向，从而最大限度地发挥TLS作为潜在生物标志物的价值。
与此相关，根据细胞组成、位置、成熟度和功能等方面的特征，提供对“TLS状态”谱的更全面的定义（图3），可能有助于更好地理解它们在癌症控制中的作用，而明确TLS状态的分子水平的特征，则有助于提高TLS作为预后预测标志物的价值。最后，更详细地理解TLS的功能及其在自身免疫毒性中的潜在作用，将有助于充分发掘TLS作为多种慢性疾病的治疗靶点的潜在价值。
图 3. 定义 TLS 的状态
**图 3. 定义 TLS 的状态。**使用一致的参数对 TLS 状态进行全面的分子定义，有助于提高其作为预后预测生物标志物的价值。更深入地解析 TLS 状态存在的方面包括，细胞组成、位置和成熟度；细胞因子和趋化因子微环境的分子特征；以及 TLS相关的 B 细胞受体 (BCR) 和 T 细胞受体 (TCR) 库。AID，活化诱导的胞苷脱氨酶；CTL，细胞毒性 T 淋巴细胞；Ig，免疫球蛋白。
参考文献
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