综述：Reading, writing and erasing mRNA methylation

以下内容为翻译并精简文章《Reading, writing and erasing mRNA methylation》后所得，文章于 2019.10 发表于《naturenature reviews molecular cell biology》，是一篇介绍 RNA 甲基化内容的综述。

Abstract

RNA甲基化可在mRNA中形成N6-甲基腺苷（m6A），这是最丰富的mRNA内部修饰，已成为控制各种生理过程中基因表达的广泛调节机制。全转录组的m6A定位揭示了m6A在细胞RNA中的分布和模式，称为表观转录组。m6A对mRNA的影响是由识别元件、操作元件、消除元件所介导。本文总结了表征和量化表观转录组的新兴方法，并讨论了有关我们对m6A识别、写入和消除元件机制和功能的理解的新概念（在某些情况下还存在争议）。

Introduction

一、RNA甲基化研究发展史

1. 1970年代发现了mRNA中N6-甲基腺苷（m6A）的存在。此后不久，发现m6A的存在可能导致mRNA的不稳定。
2. 1997年，克隆出了参与mRNA的m6A的甲基转移酶样蛋白3（METTL3）。
3. 2000年代发现酵母和拟南芥METTL3同源物的缺失分别导致孢子的形成和种子发育中的特定发育停滞，表明m6A是特定发育过程所必需的调控修饰。
4. 2012年首次发表了m6A的映射方法，生物通过RNA甲基化调控细胞中mRNA命运和功能的概念已被广泛接受。

二、m6A的修饰特点

1. 大多数m6A修饰的mRNA仅包含一个m6A位点，但某些mRNA包含20个或更多的m6A位点。
2. 大多数m6A位点在不同组织和细胞系的mRNA中分布非常相似。
3. m6A在mRNA的3’UTR和接近终止密码子处富集。
4. 基因的外显子越长，其转录后的mRNA越有可能被m6A修饰。
5. m6A修饰的mRNA富集在调节个体发育和细胞周期的基因。但编码管家基因（如核糖体蛋白）的高度稳定的转录本不富含m6A。
6. m6A是目前检测到的最丰富的RNA甲基化修饰。

三、m6A修饰mRNA的功能

1. 使mRNA变得不稳定性。
2. 使mRNA翻译上调。目前发现了两种m6A可能上调翻译的机制。1）的m6A识别蛋白YTHDF1（DF1）与真核翻译起始因子eIF3结合，eIF3可将核糖体亚基募集到mRNA上，以增强其翻译。2）当m6A在5’UTR中存在时会增强翻译。研究发现当m6A存在翻译起始不需要eIF4E（eIF4E的功能是募集eIF3），m6A的存在使翻译绕过了eIF4E而直接能募集到eIF3。m6A可能介导着一种未被发现的新的翻译起始模式。
3. 影响mRNA剪接。
4. 使mRNA与胞质的水相分离。DF蛋白家族包含一个约〜30 kDa的富含谷氨酰胺/脯氨酸/甘氨酸的低复杂性结构域。该结构域具有相互作用的能力，可以在胞质内聚集形成凝胶或液滴。DF家族蛋白与含有多个m6A的mRNA结合形成复合物，多个mRNA-DF复合物进一步聚集形成与胞质的水相分离的mRNA蛋白液滴，实现液相-液相分离（liquid–liquid phase separation，LLPS）。
5. 加速mRNA从细胞核到细胞质的运输。

m6A writers

mRNA的m6A修饰主要由METTL3-METTL14异二聚体完成，以高度特异性的方式添加到特定mRNA的特定位点上。但对这种特异性识别的生物学基础直至甚少。其中METTL3是催化亚基，用于催化mRNA的甲基化；而METTL14是结合亚基，识别并结合到目标RNA上。小鼠ES细胞中METTL3基因的缺失或CRISPR介导的METTL14失活会导致poly（A）RNA损失超过99％的m6A。一开始的实验结果认为METTL14也具有催化功能，但后续相关实验的结果却与之相反。在得到METTL3-METTL14的晶体结构及氨基酸序列后发现，METTL14中的催化结构是被破坏掉的，没有催化能力的。猜测之前“METTL14有催化功能”的结论可能是由纯化结果被METTL3污染所得出的。后续的CRISPR实验也证明了晶体结构的研究结论。

m6A readers

m6A主要通过其募集到的reader来影响mRNA的命运。 含YTH结构域的蛋白是第一类被发现的m6A的readers，为理解m6A在mRNA中的作用提供了基础。

一、Direct readers（YTH结构域）

研究人员将具有m6A识别与结合位点的蛋白质称为直接readers。通过体外实验，发现与m6A-RNA结合的蛋白质包含YTH结构域，该结构由约150个氨基酸构成，通过两个或三个色氨酸组成的“色氨酸笼”将m6A的甲基部分包裹起来，以此实现对m6A的特异性识别与结合。目前将包含YTH结构域的蛋白分为三类：YTHDC1（DC1），YTHDC2（DC2）和YTHDF（DF）蛋白家族。其中DC1，核内m6A reader，目前被可能认为与mRNA剪接、由非编码RNA XIST介导的表观遗传沉默、mRNA的核输出相关。DF，胞质内m6A reader，包含三个高度相似的蛋白：DF1、DF2、DF3。DF蛋白除了YTH结构域外，序列的其余部分（约400个氨基酸）是一个低复杂性区域，缺乏任何可识别的模块化蛋白质结构域。DF蛋白的结构域使其通常与结合的m6A-mRNA一起实现与胞质水相的分离。DC2，主要存在于睾丸中，与精子的发生相关，YTHDC2基因敲除小鼠的生殖细胞未能正确的进行减数分裂，而使精子发生凋亡，但没有其他明显的发育缺陷。DC2除了具有YTH结构域外还具有RNA解旋酶的结构域，可能会促进mRNA的翻译。

二、Indirect readers

研究人员将不具有m6A识别位点，但因为m6A的存在而有与RNA结合率变高的蛋白称为间接readers。间接readers的成因可能有两种：1）甲基化的修饰使A•U碱基对的氢键减弱，实验发现m6A的存在会使短RNA的解链温度降低至少5oC。因此，m6A降低了RNA形成特定结构的稳定性，使RNA倾向于线性，易于RNA结合蛋白与RNA的结合。m6A诱导RNA展开的特性被称为“ m6A结构性扭转”。2）是直接readers募集来的蛋白。

三、Anti readers

当m6A出现在RNA结合蛋白与RNA相结合的位点上，并且降低了蛋白与RNA的结合率，那么这些蛋白被称为反readers。

m6A erasers

erasers是指可以将RNA去甲基化的脱甲基酶。目前主要研究的erasers主要为两个：FTO和ALKBH5。其中FTO的特异性作用底物是m6Am-snRNA，猜测可能参与调控snRNA介导的mRNA剪切。ALKBH5的作用底物为m6A，对m6Am没有活性。ALKBH5在睾丸中富集，基因敲除的小鼠生长发育正常但精子发生缺陷，猜测ALKBH5介导的m6A去甲基化对于精子发育至关重要。

PS：FTO作为eraser的研究历程

对FTO的序列分析显示，其与ALKB家族具有较远的同源性，该家族被认为参与DNA和RNA的脱甲基作用。因此，最开始认为FTO参与DNA的去甲基化。但后续的研究发现FTO对DNA甲基化底物的活性较弱。随后实验发现FTO对RNA中m3U的脱甲基化活性高于DNA，故提出FTO的底物是RNA的m3U。接着实验又发现FTO对mRNA中m6A的脱甲基活性更高，故认为m6A才是FTO的真正底物，但与相同功能的酶相比，FTO将m6A脱甲基化的反应速率异常低。理解FTO功能的重大进展是发现FTO对m6Am脱甲基的催化活性明显高于m6A。在体外的生化反应测试中分析中m6Am的去甲基化速率是m6A的100倍，故认为FTO的作用底物是m6Am。但在FTO敲除细胞中poly（A）mRNA中m6Am的细胞水平增加却微不足道。这促使研究人员分析FTO敲除细胞中的其他RNA的甲基化情况。研究发现在特定snRNA的第一个核苷酸位置，FTO敲除细胞中m6Am水平增加了约1,500％。在野生型细胞中，<5％的snRNA的第一个核苷酸位置具有m6Am。但在FTO敲除细胞中具有m6Am的snRNA含量> 50％。在snRNA中m6Am的巨大变化证实了snRNA是FTO的底物，说明FTO是去snRNA的甲基化而非mRNA的甲基化。

Conclusions

m6A的添加（writer）和擦除（eraser）主要发生在细胞核内，m6A的识别（reader）既发生在核内又发生在胞质中。 在转录过程中，m6A writer 复合物为mRNA进行甲基化修饰。经过修饰的m6A-mRNA可以结合特定的核readers蛋白，主要是YTHDC1（DC1），这可能会影响剪接或mRNA输出等过程。m6A的eraser 也主要位于细胞核中。其中ALKBH5作用于m6A-mRNA，而FTO优先作用于m6Am-snRNA，可能会影响snRNA介导的mRNA剪切。当mRNA运输到细胞质后，m6A会因为结合特定的readers进而影响mRNA的稳定性、翻译能力等。在细胞质中，YTHDF1（DF1）、YTHDF3（DF3）、eIF3、METTL3等readers影响mRNA的翻译， YTHDF2（DF2）和DF3影响mRNA的降解，而IGF2BP1/2/3和FMRP可能会增强mRNA的稳定性。