审稿人：那么好发的单细胞测序的生信分析都还没人做吗？

单细胞测序有哪些创新的方法和思路？

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种理想的癌症研究工具，能够在单细胞分辨率下探测肿瘤微环境（TME）的分子异质性，并识别复杂的细胞群体。单细胞RNA测序（scRNA-seq）的应用领域正在不断扩展。为了充分发挥单细胞测序的功能，我们需要对这些数据进行深入挖掘和分析。今天，小优将带大家一起阅读这篇来自CDD Press的新作，了解这一技术的最新进展。

题目：Single-cell RNA sequencing of cervical exfoliated cells reveals potential biomarkers and cellular pathogenesis in cervical carcinogenesis

杂志：Cell Death Dis.

影响因子：IF=9.0

中科院分区：生物学一区

发表时间：2024年2月

研究背景

宫颈癌（CC）是全球妇女健康的主要威胁，主要由高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染引起。尽管现有的筛查方法有效降低了CC的发病率和死亡率，但仍存在不足。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术能够在单细胞分辨率下识别复杂和稀有的细胞群，有助于揭示宫颈癌发生过程中肿瘤微环境（TME）的异质性。该研究旨在通过scRNA-seq分析宫颈脱落细胞，探索早期检测CC的生物标志物和细胞病理机制。

材料和方法

样本来源

研究团队从15个样本中收集了56,173个宫颈脱落细胞，这些样本涵盖了正常宫颈、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）以及恶性肿瘤。所有具有异常细胞学的患者，包括LSIL、HSIL和鳞状细胞癌患者，均接受了阴道镜检查和活检。

研究思路

研究团队在收集到的宫颈脱落细胞样本中，首先进行了质量控制和过滤。随后，他们对这些细胞进行了聚类，并利用t-SNE技术生成可视化图像。通过这些分析，团队识别出了主要的细胞群，并详细研究了在不同宫颈病变中上皮细胞的单细胞表达特征。此外，研究还重点考察了B细胞、T细胞、NK细胞和骨髓细胞的不同亚群及其在各种宫颈病变中的表现。通过细胞间通讯网络分析，研究团队揭示了细胞间的复杂相互作用，特别关注了SPP1-CD44轴在宫颈癌发展中的关键作用。

结果

1. scRNA-seq结果揭示不同宫颈病变上皮细胞单细胞表达谱的特征

通过scRNA-seq技术进行细胞聚类后，研究团队利用t-SNE可视化技术揭示了22个不同的细胞簇。研究发现，不同样本的细胞表现出明显的异质性，且特定细胞群（如B细胞和T细胞）的相对丰度在不同病变阶段有显著变化。这表明在宫颈癌的发生过程中，免疫细胞的组成和相互作用发生了复杂的变化。

2. 不同宫颈病变上皮细胞单细胞的功能特征

作者对上皮细胞进行了深入分析，这些细胞涵盖了正常宫颈、LSIL、HSIL和宫颈癌（CC）的不同病变阶段。通过使用Monocle 2软件进行伪时间轨迹分析，研究揭示了上皮细胞亚群的分化状态，发现这些细胞在发展过程中表现出三种不同的分化状态。特定的基因表达模式与细胞状态的变化密切相关，例如恶性细胞标志物和增殖标志物的表达随着细胞状态的变化而增加。此外，GO和KEGG分析揭示了这些细胞群特有的生物学过程和功能通路，反映了宫颈癌的异质性和复杂性。

3. 不同宫颈病变中各个细胞亚群的特征

研究发现，B细胞可分为三种主要类型，其中滤泡B细胞在LSIL和HSIL中的比例较高，而在宫颈癌（CC）中比例最低。T细胞亚群分析显示，CD8+ T细胞的比例在LSIL中下降，但在HSIL和CC中上升，表明保护性的T细胞免疫反应在HSIL中开始建立。此外，研究还发现了与细胞毒性T细胞相关的特定基因表达模式，以及与调节性T细胞和耗竭T细胞相关的亚群。这些结果揭示了在宫颈癌发生过程中，免疫微环境逐渐向免疫抑制状态转变的过程。

4. NC, LSIL, HSIL和CC中的细胞-细胞相互作用

通过分析单细胞转录组数据中的配体-受体基因表达，作者探究了宫颈微环境中的细胞间相互作用。研究发现巨噬细胞与上皮细胞之间存在广泛的通信，特别是通过SPP1-CD44轴的相互作用。该轴在高级别鳞状上皮内病变（HSIL）和宫颈癌（CC）中的表达水平显著高于正常宫颈（NC）和低级别鳞状上皮内病变（LSIL），提示SPP1-CD44轴可能在宫颈癌发生中起到关键作用。此外，研究还发现SPP1在巨噬细胞中的表达水平在HSIL和CC中上调，而CD44在上皮细胞中的表达在HSIL中也有所增加，这进一步支持了SPP1-CD44轴在宫颈癌发展中的潜在作用。

讨论

在这项研究中，作者从15个具有不同组织学亚型的样本（从正常宫颈到宫颈癌）中建立了宫颈剥脱细胞的单细胞转录图谱。该图谱全面描述了肿瘤微环境（TME）、恶性细胞的特征以及肿瘤进展过程中细胞间串扰网络的变化。这些数据为改善宫颈癌的早期诊断、优化患者分层提供了更深入的见解，并为未来的研究提供了宝贵的资源，以发现新的生物标志物和潜在的治疗靶点。

与之前的研究一致，宫颈癌发生过程中脱落的上皮细胞进化是逐步进行的。通过scRNA-seq分析，作者发现宫颈脱落细胞由上皮细胞、中性粒细胞、肥大细胞和免疫细胞组成。同时，作者鉴定了几个新基因，包括SRGN和HIST1H1C。最近的报道指出，SRGN是一种促进食管癌和鼻咽癌转移的致癌基因，而HIST1H1C上调并促进肝癌发生。然而，SRGN和HIST1H1C的功能尚未在宫颈癌中得到探索。有趣的是，从研究中可以推断出SRGN和HIST1H1C可能是促进宫颈癌发展的新型生物标志物。

创新性

1、LSIL免疫细胞分析: 

通过对LSIL宫颈脱落细胞的scRNA-seq分析，研究确定了多个不同的免疫细胞亚群，并描述了LSIL微环境的变化。LSIL样本中包含大量细胞毒性T细胞和自然杀伤T细胞，且CD8细胞毒性评分高于HSIL和肿瘤组，显示出更为激活的免疫状态。

2、诊断生物标志物: 

基于生物信息学分析，研究通过验证临床样本，建立了新型的宫颈癌（CC）诊断生物标志物，具有巨大的临床意义。

3、APOE巨噬细胞与LAMs的相似性: 

研究发现APOE巨噬细胞与LAMs（肝巨噬细胞）相似，证实了可以在宫颈剥脱细胞中检测到LAMs，并表明LAMs在肿瘤发生过程中起着多种作用。

局限性

1、上皮细胞亚簇的假阳性结果: 

研究发现上皮细胞亚簇1的一些细胞出现在正常宫颈（NC）组中，尽管这些细胞的百分比很低（3%），这可能是一个假阳性结果，与先前的研究一致。

2、中性粒细胞的主要地位: 

研究结果表明，中性粒细胞是一些样品中的主要细胞类型，支持了先前的报道，即中性粒细胞是子宫颈中的主要免疫细胞类型。尽管排除了患有急性外阴阴道念珠菌病和细菌性阴道病的患者，中性粒细胞的百分比仍与活检采集的样本不同。

3、scRNA-seq的重要性与未来验证: 

scRNA-seq揭示了肿瘤相关的中性粒细胞推动非小细胞肺癌进展的证据，强调了包括中性粒细胞在内的重要性，以避免遗漏有关中性粒细胞和宫颈癌（CC）之间关系的信息。另一方面，需要进一步验证研究发现，包括宫颈癌发展过程中细胞的分子特征。

小优有话说

作者团队通过单细胞RNA测序技术对宫颈脱落细胞进行分析，探讨宫颈癌发生过程中不同细胞类型之间的相互作用，特别关注肿瘤相关纤维细胞和免疫细胞之间的相互作用。

研究建立了15例不同组织学亚型的宫颈脱落细胞单细胞转录图谱，全面描述了肿瘤微环境（TME）、恶性细胞的特征以及肿瘤进展过程中细胞间串扰网络的变化。这些数据为改善宫颈癌前病变诊断和患者分层提供了更深入的见解，并为发现生物标志物和潜在的治疗靶点提供了宝贵的资源。